Burada, antibakteriyel aktiviteyi inhibe Tayvanlı yeşil propolis ayıklamak ve karakterize etmek için bir çözücü olarak etanol kullanarak için protokol sıyoruz. Bu protokol Tayvanlı yeşil propolisin kalitesini belirlemek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Gösteri prosedürü Chun'Ting Chen ve Yi'Hsuan Chien, benim laboratuvar doktora öğrencileri olacaktır.
Başlamak için, Tayvan yeşil propolis 100 gram tartmak. Bir baharat öğütücü kullanarak, parçaları herhangi bir büyük parçacıklar olmadan ince bir toz içine öğütülür emin olmak için propolis eziyet. Beş şişe leri ayarlayın ve her biri için suda etanol çeşitli konsantrasyonlarda 100 mililitre ekleyin.
Her şişedeki etanol çözeltisine 10 gram öğütülmüş propolis karıştırın ve 25 santigrat derecede 48 saat boyunca 250 RPM'de sallayarak kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, etanol özlerini filtrelemek için 25 mikrometre gözenek boyutuna sahip filtre kağıdı kullanın. Hacimsel bir şişe kullanarak, filtratları %95 etanol ile 100 mililitrelik orijinal hacmine göre yeniden oluşturur.
Yeniden oluşturulmuş özleri kullanıma hazır olana kadar eksi 20 derecede saklayın. HPLC için özleri hazırlamak için hazır olduğunuzda, 10 dakika boyunca 40 santigrat derece her ekstre 10 mililitre konsantre vakum buharlaşma kullanın. Kuru maddeyi 45 derecede 24 saat pişirin.
Daha sonra, kuru madde her örnek 10 mililitre ile yeniden oluşturmak 95% etanol. 0,22 mikrometre gözenek boyutuna sahip bir şırınga filtresi kullanarak, her özü yeniden filtreleyin ve HPLC ile doğrudan analiz için filtrat toplayın. Standart bir eğri oluşturmaya başlamak için, 88,8 ila 11,2 oranında su çözeltisi için mobil faz metanol bir litre hazırlamak.
Mobil faz çözeltisini çözücü olarak kullanarak, metin protokolünde belirtildiği gibi propolin standart konsantrasyonlarının seri seyreltmelerini hazırlayın. Her standart konsantrasyondan 20 mikrolitreyi en düşük konsantrasyondan en yükseğe sırayla ters faz sütunlarına enjekte edin. Daha sonra, HPLC sütununa 30 santigrat derece ayarlayın, UV dedektörünün feragat uzunluğunu 280 nanometreye, akış hızını dakikada bir mililitreye, kayıt süresini ise 20 dakikaya ayarlayın.
Standartları en az üç kez analiz edin. Bundan sonra, ölçüm yanıtını konsantrasyona takmak için hesaplama sayfası yazılımını kullanın ve bu da belirlenen bir denklem ve R kare değerine sahip standart bir eğriyle sonuçlanır. Özleri analiz etmeye başlamak için, ters faz sütununa her ekstrenin 20 mikrolitresini enjekte edin.
HPLC sütunu 30 santigrat derecelik bir sıcaklığa ve dakikada bir mililitre akış hızına ayarlayın. UV dedektörünün feragat süresini 280 nanometreye, kaydedici süresini ise 20 dakikaya ayarlayın. Özleri en az üç kez analiz edin.
Daha sonra, her etanol ekstresinde propolin konsantrasyonu belirlemek için standart eğriyi kullanın. Test organizmaları ve etanol ekstreleri hazırlandıktan sonra, 96 kuyu plaka kuyularına mililitre başına 0,156 ila 640 mikrogram arasında değişen seyreltilmiş etanol ekstresi 10 mikrolitre ekleyin. Her kuyudaki hacmi 100 mikrolitreye ayarlamak için et suyu kullanın ve tüm seyreltmelerde %5 DMSO'yu koruduğundan emin olun.
Daha sonra, 96 kuyu plakasının her kuyunun içine 100 mikrolitre bakteri kültürü aşılamak. Kültür 48 saat boyunca 37 derecede. Bulanıklığa göre bakteri büyümesini analiz etmek ve minimum inhibitör konsantrasyonu belirlemek için 590 nanometre bir mikroplaka okuyucu kullanın.
Bundan sonra, bir agar plaka üzerine büyüme sergilenen her kuyudan sıvı kültür 10 mikrolitre aşılamak. 24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Bakteriyel aktiviteyi belirlemek için görünür bakteriyel büyüme ortaya en düşük konsantrasyonu belirleyin.
Hücre büyümesini tamamen ortadan kaldıran konsantrasyon minimum bakteri konsantrasyonu olarak kabul edilir. Bu çalışmada, Tayvanlı yeşil propolis etanol ile ayıklanır. Kuru madde verimi yüksek konsantrasyonda etanol kullanıldığında en yüksek, su kullanıldığında ise en düşük gibi görünün.
Bu sonuçlar, organik bir çözücünün bu ekstraksiyon sırasında en iyi performansı gösterdiğini ve verimin etanol konsantrasyonu ile olumlu ilişkili olduğunu göstermektedir. Aynı şekilde, propolin konsantrasyonu olumlu ekstraksiyon sırasında etanol konsantrasyonu ile ilişkili gibi görünüyordu, propolinlerin en yüksek verim ile elde edilen 95%ve 99.5%etanol özleri. Daha sonra Etanol ekstrelerinin S aureus ve E coli'ye karşı antibakteriyel etkileri araştırılır.
S aureus için ortalama minimum inhibitör konsantrasyonu mililitre başına 10 ila 20 mikrogram arasında, ortalama bakteri konsantrasyonu ise mililitrede 20 mikrogram olarak görünmaktadır. Su ekstreleri, ancak, S aureus karşı herhangi bir antibakteriyel etkisi yoktu. Su veya etanol özleri kullanırken E coli için antibakteriyel etki gözlenmez.
Önemli deneysel prosedürbiri taşlama sırasında Tayvanlı yeşil propolis tekdüzelik kaçınarak olduğunu.
