Yazarlar, dr. Kees Jalink'i (Hollanda Kanser Enstitüsü ve van Leeuwenhoek İleri Mikroskopi Merkezi, Amsterdam, Hollanda) bize H188 cAMP FRET biyosensörü ve Kenny Trinh'i (Güney Alabama Mühendislik Fakültesi) özel olarak geliştirilen programlama komut dosyalarımızı çalıştırmak için geçen süreyi azaltmada teknik yardım sağladığı için kabul etmek istiyor.
Yazarlar fon kaynaklarını kabul etmek istiyor: Amerikan Kalp Derneği (16PRE27130004), Ulusal Bilim Vakfı; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

<ol>
	<li>Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+adenosine+3':5'-monophosphate+and+adenosine+3':5'-monophosphate-dependent+protein+kinase+in+heart+tissue.">Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue.</a> The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).</li><li>Terrin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGE1+stimulation+of+HEK293+cells+generates+multiple+contiguous+domains+with+different+[cAMP]:+role+of+compartmentalized+phosphodiesterases.">PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases.</a> The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).</li><li>Bacskai, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+dynamics+of+cAMP+and+protein+kinase+A+subunits+in+Aplysia+sensory+neurons.">Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons.</a> Science. 260, 222-226 (1993).</li><li>Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+aspects+of+cAMP+signalling+in+cardiac+myocytes.">Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 35, 1343-1348 (2008).</li><li>Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+compartmentation+of+cyclic+AMP+and+protein+kinase+in+heart.">Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart.</a> Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).</li><li>Hohl, C. M., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentation+of+cAMP+in+adult+canine+ventricular+myocytes.+Relation+to+single-cell+free+Ca2++transients.">Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients.</a> Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).</li><li>Rich, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+uniform+extracellular+stimulus+triggers+distinct+cAMP+signals+in+different+compartments+of+a+simple+cell.">A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).</li><li>Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+adenylyl+cyclase+reveals+the+significance+of+cAMP+compartmentation+on+pulmonary+microvascular+endothelial+cell+barrier.">Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier.</a> Circulation Research. 98, 675-681 (2006).</li><li>Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assessment+of+local+phosphodiesterase+activity+using+tailored+cyclic+nucleotide-gated+channels+as+cAMP+sensors.">In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors.</a> The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).</li><li>Blackman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDE4D+and+PDE4B+function+in+distinct+subcellular+compartments+in+mouse+embryonic+fibroblasts.">PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).</li><li>Sayner, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+cAMP-induced+lung+endothelial+hyperpermeability+revealed+by+Pseudomonas+aeruginosa+ExoY.">Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY.</a> Circulation Research. 95, 196-203 (2004).</li><li>Klarenbeek, J., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+cAMP+with+an+EPAC-based+FRET+sensor+in+single+living+cells.">Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).</li><li>Surdo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+biosensor+uncovers+cAMP+nano-domains+at+&#946;-adrenergic+targets+that+dictate+precise+tuning+of+cardiac+contractility.">FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at &#946;-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility.</a> Nature Communications. 8, 15031 (2017).</li><li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer:+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator.">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).</li><li>Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fanciful+FRET.">Fanciful FRET.</a> Science's STKE. 2006, (2006).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+History+of+FRET:+From+conception+through+the+labors+of+birth.">The History of FRET: From conception through the labors of birth.</a> Reviews in Fluorescence. 3, (2006).</li><li>Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-224 (2006).</li><li>Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+by+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+(FRET)+microscopy+in+live+cells.">Imaging protein-protein interactions by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells.</a> Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).</li><li>Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenylyl+cyclases+and+the+interaction+between+calcium+and+cAMP+signalling.">Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling.</a> Nature. 374, 421-424 (1995).</li><li>Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+gene+expression+to+cAMP+signalling:+role+of+CREB+and+CREM.">Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 30, 27-38 (1998).</li><li>Rebhun, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotides,+calcium,+and+cell+division.">Cyclic nucleotides, calcium, and cell division.</a> International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).</li><li>Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fourth-generation+Epac-based+FRET+sensors+for+cAMP+feature+exceptional+brightness,+photostability+and+dynamic+range:+characterization+of+dedicated+sensors+for+FLIM,+for+ratiometry+and+with+high+affinity.">Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity.</a> PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).</li><li>Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET:+signals+hidden+within+the+noise.">FRET: signals hidden within the noise.</a> Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).</li><li>Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+decipher+the+information+content+contained+within+cyclic+nucleotide+signals.">Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals.</a> The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).</li><li>Annamdevula, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+imaging+of+FRET-based+sensors+reveals+sustained+cAMP+gradients+in+three+spatial+dimensions.">Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions.</a> Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).</li><li>Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+FRET+using+spectral+techniques.">Assessing FRET using spectral techniques.</a> Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).</li><li>Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+limitations+of+FRET+measurements.">Overcoming limitations of FRET measurements.</a> Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).</li><li>Fink, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Earcths+Resources+from+Space.">Monitoring Earcths Resources from Space.</a> Technology Review. 75, 32-41 (1973).</li><li>Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Spectrometry+for+Earth+Remote+Sensing.">Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing.</a> Science. 228, 1147-1153 (1985).</li><li>B&#252;cherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET-FLIM+applications+in+plant+systems.">FRET-FLIM applications in plant systems.</a> Protoplasma. 251, 383-394 (2014).</li><li>Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spectral+FRET+imaging+microscopy+for+monitoring+nuclear+protein+interactions.">Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions.</a> Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).</li><li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair.">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).</li><li>Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+FRET+Efficiency+using+Excitation-Scanning+Hyperspectral+Imaging.">Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging.</a> Biophysical Journal. 112, 586 (2017).</li><li>Favreau, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation-scanning+hyperspectral+imaging+microscope.">Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope.</a> Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).</li><li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes.">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).</li><li>Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+multiphoton+spectral+imaging+and+its+use+for+measuring+resonance+energy+transfer.">Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer.</a> Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).</li><li>Agarwal, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+cAMP+signaling+associated+with+lipid+raft+and+non-raft+membrane+domains+in+adult+ventricular+myocytes.">Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).</li><li>Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+signaling+compartmentation:+Adenylyl+cyclases+as+anchors+of+dynamic+signaling+complexes.">cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes.</a> Mol Pharmacol. , (2017).</li><li>Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+FRET+measurement+using+emission-spectral+unmixing+with+independent+excitation+crosstalk+correction.">Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction.</a> Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).</li><li>Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IIem-spFRET:+improved+Iem-spFRET+method+for+robust+FRET+measurement.">IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).</li><li>Levy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpRET:+highly+sensitive+and+reliable+spectral+measurement+of+absolute+FRET+efficiency.">SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency.</a> Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).</li><li>West, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+Measurements+Allow+Separation+of+FRET+Signals+from+Non-Uniform+Background+Fluorescence.">Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence.</a> Biophysical Journal. 112, 453 (2017).</li><li>Annamdevula, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+for+characterizing+and+comparing+hyperspectral+microscopy+systems.">An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems.</a> Sensors. 13, 9267-9293 (2013).</li></ol>

Dr. Leavesley ve Rich, spektral görüntüleme teknolojilerini ticarileştirmek için kurulan spectracyte, LLC bir start-up şirketine olan finansal ilgilerini açıkladılar. Ancak, bu protokolde açıklanan tüm prosedürler SpectraCyte, LLC ile ilişkili olmayan ticari olarak mevcut ürünler kullanılarak gerçek yapılmıştır.

FRET biyosensörlerinin gelişimi, döngüsel nükleotid sinyallerinin tek hücrelerde ölçülmesini ve görselleştirilmesini sağladı ve hücre altı sinyal olaylarını görselleştirmek için büyük bir vaat var13,22,37,38. Bununla birlikte, FRET biyosensörlerinin kullanımı, birçok floresan protein bazlı FRET muhabirinin düşük sinyal-gürültü özellikleri ve FRET muhabirlerinin zayıf transfeksiyon veya ifade verimlilikleri de dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar sunar (bu, PMVEC'ler gibi belirli hücre hatlarında özellikle zor olabilir)23,24. Zayıf ifade edilen floresan proteinlerin görüntülenmesi, oranmetrik FRET hesaplamaları ile birlikte, genellikle hesaplanan FRET verimliliğinde yüksek derecede belirsizlik veya dalgalanmaya neden olur. FRET ölçümlerinin güvenilirliğini artırmak amacıyla, biz ve diğerleri daha önce FRET sinyallerini ölçmek ve floresan etiketler ile otoflüoresan etkileri arasındaki floresan sinyalleri ile çapraz konuşma veya kanamayı azaltmak için hiperspektral görüntüleme ve analizin kullanımını gösterdik26,31,32,39. Sinyal gücündeki sınırlamalar nedeniyle, bu spektral FRET çalışmaları çok yakın zamana kadar iki (X ve Y) mekansal boyutla sınırlıydı. Bu nedenle, bir hücre içindeki FRET değişikliklerinin tek dilimli bir görünümünü sağladılar.
Son çalışmalarda, FRET'in (ve buna karşılık gelen cAMP seviyelerinin) sadece XY düzleminde değil, aynı zamanda XZ ve YZ uçakları arasında da mekansal olarak dağıtıldığını gördük25. Burada açıklanan hiperspektral FRET görüntüleme yaklaşımı, FRET ve döngüsel nükleotid (cAMP) değişikliklerini görselleştirme ve ölçme yeteneğimizi üç mekansal boyuta genişleterek sinyal bölmelemenin değerlendirilmesi için yeni olanaklar sunar. Bu 4 boyutlu (X, Y, Z ve φ) hiperspektral görüntüleme ve analiz yaklaşımı, cAMP gradyanlarının üç mekansal boyutta ölçülmesine ve görselleştirilmesine olanak tanırken, tekdüze olmayan arka plan sinyallerini de hesaba katmaktadır. Burada, forskolin kaynaklı cAMP uzamsal gradyanları örneği ile bu yaklaşımın nasıl uygulanacağı konusunda göstermiştik. Tedavi sonrası görüntü verilerinde, cAMP mekansal gradyanlar apikalden hücrenin bazal tarafına kadar gözlenebilir (Şekil 7 ve Şekil 8). Forskolin ile tedavi üzerine üretilen cAMP hücre-hücre birleşimlerine ulaşmamıştır (Şekil 7 ve Şekil 8).
Burada açıklanan metodolojiyi kullanarak, FRET verimliliklerinin doğru tahmin edilmesine izin vermek için farklı arka plan ve otoflüoresans sinyal kaynaklarını hesaba katmak önemliydi. Doğrusal karıştırma, imzaları floresan ilgi problarından farklıysa, benzersiz arka plan spektrumlarını hesaba katmak için potansiyel bir yol sağlar. Özellikle, doğrusal karıştırma, arka plan ve otomatik mağazapsans sinyallerini ayırmak için standart arka plan çıkarmadan daha uygundur. 40,41,42 Burada gösterilen örnekte, üç farklı spektral imza ölçüldü ve imzanın tepe emisyon dalga boyunu temel alan bir isim atandı: 424 nm arka plan spektrumu (muhtemelen kapak flüoresansından), 504 nm arka plan spektrumu (muhtemelen yansıyan veya arkaya dağılmış ışık nedeniyle) ve 574 nm arka plan spektrumu (muhtemelen hücre veya hücresel matris otoflüoresansı nedeniyle). Bu imzaları hesaba katmamanın etkilerini göstermek için iki spektral kitaplık oluşturuldu ve karıştırılmamış görüntüler karşılaştırıldı. İlk olarak, örnekteki floresan etiketleri içeren bir spektral kütüphane oluşturuldu, Turkuaz, Venüs ve DRAQ5, 3 bileşenli kütüphane oluşturuldu ve etiketlendi. İkinci olarak, ek olarak üç arka plan spektral imzasını içeren bir spektral kitaplık oluşturuldu ve 6 bileşenli kitaplık etiketlendi. Yukarıda gösterildiği gibi, 6 bileşenli kitaplığa karıştırma (arka plan karıştırma) arka plan sinyallerinin kaldırılmasına izin verirken, 3 bileşenli kitaplıkla karıştırmadık (Şekil 9). Önceki çalışmada, hem floresan etiketleri hem de arka plan imzalarını oluşturan bir spektral kitaplık kullanırken doğrusal karıştırma ile ilişkili kök ortalama kare hatanın (RMSE) azaldığını göstermiştik. Arka plan floresanının eksenel dağılımının genellikle tekdüze olmadığı ve bu nedenle basit bir arka plan çıkarmanın görüntü verilerini düzeltmek için çalışmayacağı belirtilmelidir. Bu nedenle, doğru arka plan kaldırma ve güvenilir FRET ölçümleri sağlamak için spektral karıştırmama yaklaşımına ihtiyaç vardır.
Spektral görüntüler elde ederken mümkün olan en iyi sistem ve kamera ayarlarını seçmek için sistem parametrelerini optimize etmek önemlidir. Genel amaç, satın alma süresini en aza indirirken ve fotobleaching'i önlerken SNR'yi optimize etmek olmalıdır. 43 Bu nedenle, bir görüntüleme sistemini optimize ederken, mekansal, zamansal ve spektral çözünürlükler arasında bir uzlaşmaya sıklıkla ihtiyaç vardır. Bu çalışmalarda, protokol bölümünde açıklandığı gibi iğne deliği boyutu, lazer gücü, tarama hızı, tarama boyutu ve çerçeve ortalaması dahil olmak üzere sistem ve kamera ayarları için en uygun değerler seçilmiştir. Bu ayarlar kullanılarak, 80 nm / piksel uzamsal örnekleme, spektral z-yığını başına ~3 dakikalık zamansal örnekleme (~ 10 saniye / XY görüntü) ve 10 nm aralıklı spektral örnekleme ihmal edilebilir veya minimum fotobleaching ile elde edilir.
FRET verimliliğinin doğru tahminlerini sağlamak için, donör ve alıcı spektrumlarını 1:1 stoichiometry ve özdeş ekssitasyon dalga boyları ile beklendiği gibi ölçmek gerekir (Şekil 3). Turkuaz ve Venüs spektrası Turkuaz tepe emisyon dalga boyu açısından normalleştirildi. Bu spektral kütüphane kullanılarak tahmin edilen FRET verimliliği, literatürde bildirilenlere benzer değerler üretti12,22. Genellikle, kitaplıktaki endmember spektrumu birliğe normalleştirilir. Bununla birlikte, FRET verimliliğini doğru bir şekilde hesaplamak için, alıcı spektrum donör spektrumuna göre edinilmelidir (yani, equimolar konsantrasyonda veya 1:1 stoichiometry'de ve aynı ekscitasyon dalga boyuna atıfta bulunulmalıdır). Düzgün bir şekilde inşa edilmiş bir kütüphanenin kullanımına ek olarak, FRET verimliliğinin uygun şekilde tahmin edilmesi ve analiz yapıtlarının önlenmesi için çeşitli adımlar yer almaktadır. Bunlar arasında yeterli sinyal yoğunluğuna sahip bir ifade hücresi seçmek (Şekil 11), FRET verimliliğini tahmin etmeden önce karıştırılmamış görüntülerin yumuşatılmış olması (bu örnekte Gauss bulanıklığı uygulanmıştır), maskeyi oluşturmak için uygun bir eşik değeri kullanılması (Şekil 10) ve donör ve alıcının yok olma katsayılarını kullanarak bir düzeltme faktörünün tahmin edilmesi (Ek File_Spectral Kütüphanesi) sayılamaz. Bu adımlar izlendiğinde, FRET verimliliğinin ve alttaki cAMP seviyelerinin 3 boyutlu dağılımları tek hücrelerde doğru bir şekilde görselleştirilebilir.
Yerelleştirilmiş cAMP sinyalleri hedeflenen FRET biyosensörleri kullanılarak 2 uzamsal boyutta tahmin edilmiştir13,37. Bununla birlikte, FRET problarının belirli hücre altı bölmelere (örneğin plazma zarı veya lipid salları) hedeflanması tipik olarak yerel prob konsantrasyonunun artmasına neden olur. Bu, intermoleküler veya bimoleküler FRET nedeniyle kullanıma sunulan ölçüm yapıtlarına neden olabilir. Buna ek olarak, burada ve Annamdevula et.al., 2018'de sunulan sonuçlar, Sitometri A25, çözünür veya hedeflenen problardan FRET'in 3 boyutlu ölçümlerinin önemini göstermektedir.
cAMP sinyallerinin üç mekansal boyutta ölçülmesinin önemine rağmen, bu yaklaşımın sınırlamaları da vardır. En kısıtlayıcı sınırlama, spektral z-yığını başına yaklaşık 3 dakika olmak üzere gerekli uzun alım süreleridir. Bu alım oranı, hücrelerdeki sabit durum cAMP dağılımları dışında bir şeyi algılamak için bu yaklaşımın kullanılmasını önler. Bununla birlikte, sunulan sonuçlar, standart 2 boyutlu (x, y) ölçümlerin kritik tamamlayıcıları olarak quasi - sabit durum 3 boyutlu (x, y, z) cAMP ölçümlerinin dahil edilmesinin önemini göstermektedir. Gelecekte etiketli proteinleri ve hücresel yapıları deneysel tasarıma dahil etmek ilginç olacaktır. Proteinleri (ve/veya yapıları) etiketlemek için kullanılan floroforların dikkatli bir şekilde tercih etmesi, etiketli proteinlerin ve FRET'in 3 boyutlu dağılımlarının ek alım hızı kaybı olmadan değerlendirilmesine izin verecektir. Bu da, etiketli proteinlerin yakınındaki lokalize cAMP sinyallerinin ve cAMP sinyallerinin üç uzamsal boyutta ölçülmasına izin verecek, böylece hedeflenen cAMP problarına önemli bir deneysel tamamlayıcı sunacak ve canlı hücrelerdeki 3 boyutlu cAMP dağılımlarının hiperspektral ölçümlerinin yararını daha da genişletecektir.

Siklik adenozin monofosfat (cAMP), hücre bölünmesi, kalsiyum akışı, gen transkripsiyonu ve sinyal transdüksiyonu dahil olmak üzere önemli hücresel ve fizyolojik süreçlerde yer alan ikinci bir habercidir. Büyüyen bir kanıt gövdesi, hücrede sinyal özgüllüğünün elde edildiği cAMP bölmelerinin varlığını göstermektedir1, 2,3,4,5,6,7. Yakın zamana kadar, cAMP bölmeleme, farklı G bağlantılı reseptör agonistleri 8 ,9, 10,11tarafından indüklenen farklı fizyolojik veya hücresel etkilere dayanarakçıkarılmıştır. Daha yakın zamanda, FRET tabanlı floresan görüntüleme probları,12, 13,14hücresinde cAMP sinyallerinin doğrudan ölçümü ve gözlemlenmesi için yeni yaklaşımlar sağlamıştır.
Förster rezonans enerji transferi (FRET), donör ve alıcı moleküller arasında, moleküller yakın mesafedeyken radyatif olmayan bir şekilde enerji transferinin gerçekleştiği fiziksel bir olgudur15,16. FRET tabanlı floresan göstergelerin geliştirilmesiyle, bu fiziksel fenomen biyolojik uygulamalarda protein-protein etkileşimlerini incelemek için kullanılmıştır17, protein ko-lokalizasyonu18, Ca+2 sinyal19, gen ekspresyasyonu20, hücre bölünmesi21 ve döngüsel nükleotid sinyali. FRET tabanlı cAMP göstergeleri tipik olarak bir cAMP bağlama etki alanı, bir donör floroforu ve bir kabul edici florofor22'denoluşur. Örneğin, bu metodolojide kullanılan H188 cAMP sensör12,22, Turkuaz (donör) ve Venüs (kabul eden) floroforlar arasında sıkışmış, Epac'tan elde edilen bir cAMP bağlama alanından oluşur. Bazal koşullarda (ilişkisiz), Turkuaz ve Venüs, FRET'in floroforlar arasında meydana geldiği bir yönelimdedir. cAMP'nin bağlama alanına bağlanması üzerine, Turkuaz ve Venüs'ün birbirinden uzaklaşması ve FRET'te bir azalmaya neden olması için uygun bir değişiklik meydana gelir.
FRET tabanlı görüntüleme yaklaşımları, bir hücre içindeki cAMP sinyallerini araştırmak ve görselleştirmek için umut verici bir araç sunar. Bununla birlikte, mevcut FRET tabanlı mikroskobik görüntüleme teknikleri genellikle FRET'i hücre altı mekansal netlik ile ölçmek için yeterli sinyal gücü elde etmede kısmen başarılıdır. Bunun nedeni, birçok FRET muhabirinin sınırlı sinyal gücü, FRET verimliliğindeki değişiklikleri doğru bir şekilde ölçmek için gereken yüksek hassasiyet seviyesi ve hücresel otofluoresans23,24gibi şaşırtıcı faktörlerin varlığı da dahil olmak üzere çeşitli faktörlerden kaynaklanmaktadır. Sonuç genellikle zayıf SNR ile boğuşan ve FRET'teki hücre altı değişikliklerin görselleştirilmesini çok zor hale getiren bir FRET görüntüsüdür. Ek olarak, mekansal olarak lokalize cAMP sinyallerinin araştırılması neredeyse sadece iki mekansal boyutta gerçekleştirilmiştir ve eksenel cAMP dağılımı nadiren25olarak kabul edilmiştir. Bunun nedeni, düşük SNR'nin cAMP degradelerini üç uzamsal boyutta ölçme ve görselleştirme yeteneğini engellemesidir. Düşük SNR'li FRET sensörlerini kullanmanın sınırlamalarını aşmak için, FRET'i tek hücrelerde ölçmek için hiperspektral görüntüleme ve analiz yaklaşımları uyguladık25,26,27.
Hiperspektral görüntüleme yaklaşımları NASA tarafından uydu görüntülerinde bulunan karasal nesneleri ayırt etmek için geliştirilmiştir28,29. Bu teknikler o zamandan beri floresan mikroskopi alanı30spektral dedektörler sunan çeşitli ticari konfokal mikroskop sistemleri ile çevrilmiştir. Geleneksel (spektral olmayan) floresan görüntülemede, örnek bir bant geçiş filtresi veya lazer çizgisi kullanılarak heyecanlanır ve emisyon, genellikle floroforların tepe emisyon dalga boylarına uyacak şekilde seçilen ikinci bir bant geçiş filtresi kullanılarak toplanır. Bunun aksine, hiperspektral görüntüleme yaklaşımları, floresanemisyonu 26,31,32veya heyecan33 ,34'üntam bir spektral profilini belirli dalga boyu aralıklarında örneklemeyi amaçlamaktadır. Önceki çalışmalarımızda, hiperspektral görüntüleme ve analiz yaklaşımlarının, geleneksel filtre tabanlı FRET görüntüleme tekniklerine kıyasla hücrelerdeki FRET sinyallerinin daha iyi nicelleştirilmesini sunabileceğini gösterdik26. Burada, cAMP dağılımlarını üç mekansal boyutta ölçmek ve görselleştirmek için 4 boyutlu (x, y, z ve φ) hiperspektral FRET görüntüleme ve analizi yapmak için bir metodoloji sunuyoruz. Bu yaklaşımlar, agonist kaynaklı cAMP uzamsal gradyanlarının tek hücrelerde görselleştirilmesine izin verdi25. İlginçtir ki, agoniste bağlı olarak, hücrelerde cAMP gradyanları belirgin olabilir. Burada sunulan metodoloji, FRET ölçümlerinin doğruluğunu artırmak için tekdüze olmayan arka plan ve hücresel otofluoresans spektral karıştırmayı kullanır. Bu metodoloji pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde (PMVEC) cAMP FRET biyosensörü kullanılarak gösterilmiş olsa da, metodoloji alternatif FRET muhabirleri veya alternatif hücre hatları ile kullanılmak üzere kolayca değiştirilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>Solvent used to prepare stock solution forskolin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Nuclear label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6178</td>
			<td>Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3917</td>
			<td>Adenyly cyclase activator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H188 Cyclic AMP FRET biosensor</td>
			<td>Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink</td>
			<td>Gift</td>
			<td>Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>image.net</td>
			<td>Free download</td>
			<td>Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrating Sphere</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>FOIS-1</td>
			<td>Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000-015</td>
			<td>Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2019a</td>
			<td>Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Nikon A1R</td>
			<td>Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Software</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Software dongle</td>
			<td>used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST-Traceable Calibration Lamp</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>LS-1-CAL-INT</td>
			<td>A lamp with a known spectrum for use as a standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>coomonly used buffer suring cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs)</td>
			<td>In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama</td>
			<td>Isolated from Rat pulmonary microvasculature</td>
			<td>PMVECs form inner lining of a blood vessel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>3010</td>
			<td>Microscope slides used for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mounting Media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36961</td>
			<td>If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>QE65000</td>
			<td>Used to measure spectral response of the light source (?)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrodes Buffer</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td>Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Round Microscope Cover Slips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545102</td>
			<td>Cells were grown on round glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X Ojective</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &#8734;/0.15-0.18 WD 0.27</td>
			<td>water immersion and commonly used objective for cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of 3-dimensional camp distributions in living cells using 4-dimensional (x, y, z, and &lambda;) hyperspectral fret imaging and analysis

Siklik AMP, çok çeşitli hücresel ve fizyolojik aktivitelerde yer alan ikinci bir habercidir. Çeşitli çalışmalar, cAMP sinyallerinin bölümlere ayırdığını ve bölümlere ayırmanın cAMP sinyal yolu içindeki sinyal özgüllüğüne katkıda bulunduğunu göstermektedir. Fӧrster rezonans enerji transferi (FRET) bazlı biyosensörlerin geliştirilmesi, hücrelerdeki cAMP sinyallerini ölçme ve görselleştirme yeteneğini daha da ileriye taşıdı. Bununla birlikte, bu ölçümler genellikle verilerin yanlış yorumlanmasına neden olabilecek iki uzamsal boyutla sınırlıdır. Bugüne kadar, doğası gereği düşük sinyal-gürültü oranı (SNR) sergileyen FRET sensörlerinin kullanılmasındaki teknik sınırlamalar nedeniyle, üç uzamsal boyutta (x, y ve z) cAMP sinyallerinin çok sınırlı ölçümleri olmuştur. Buna ek olarak, geleneksel filtre tabanlı görüntüleme yaklaşımları, spektral çapraz konuşma, sınırlı sinyal gücü ve otofluoresans gibi çeşitli faktörler nedeniyle yerelleştirilmiş hücre altı bölgelerdeki cAMP sinyallerinin doğru ölçümü için genellikle etkisizdir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek ve FRET tabanlı biyosensörlerin birden fazla floresanla kullanılmasına izin vermek için, FRET verimliliklerini hesaplamak için spektral özgüllük ve FRET sinyallerini ek floresan etiketlerden gelen şaşırtıcı otoflüoresan ve/veya sinyallerden spektral olarak ayırma yeteneği sağlayan hiperspektral FRET görüntüleme ve analiz yaklaşımları geliştirdik. Burada, hiperspektral FRET görüntülemenin uygulanması için metodolojinin yanı sıra spektral karıştırma yapmak için ne az örneklenmiş ne de aşırı örneklenmiş uygun bir spektral kütüphane inşa etme ihtiyacını sunuyoruz. Pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde (PMVEC) üç boyutlu cAMP dağılımlarının ölçümü için bu metodolojiyi sunarken, bu metodoloji cAMP'nin çeşitli hücre tiplerindeki mekansal dağılımlarını incelemek için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional x, y, z, and Î» Hyperspectral FRET Imaging and Analysis at JoVE.com

Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional x, y, z, and &lambda; Hyperspectral FRET Imaging and Analysis

Fӧrster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı sensörlerin doğal düşük sinyal-gürültü oranı (SNR) nedeniyle, cAMP sinyallerinin ölçümü, özellikle üç uzamsal boyutta zor olmuştur. Burada, cAMP dağılımının üç mekansal boyutta ölçülemesine izin veren hiperspektral FRET görüntüleme ve analiz metodolojisini açıklıyoruz.

4 Boyutlu (x, y, z ve φ) Hiperspektral FRET Görüntüleme ve Analizi Kullanılarak Canlı Hücrelerde 3 Boyutlu cAMP Dağılımlarının Ölçümü

Cyclic AMP is a second messenger that is involved in a wide range of cellular and physiological activities. Several studies suggest that cAMP signals are ...

measurement-3-dimensional-camp-distributions-living-cells-using-4

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and &lambda;) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis

3.8K Görüntüleme.  University of South Alabama. Fӧrster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı sensörlerin doğal düşük sinyal-gürültü oranı (SNR) nedeniyle, cAMP sinyallerinin ölçümü, özellikle üç uzamsal boyutta zor olmuştur. Burada, cAMP dağılımının üç mekansal boyutta ölçülemesine izin veren hiperspektral FRET görüntüleme ve analiz metodolojisini açıklıyoruz.

Video: Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional x, y, z, and λ Hyperspectral FRET Imaging and Analysis

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Memeli Hücrelerinde Glikoproteinler N-bağlı Şeker Zincirler Pulse-kovalamaca Analizi

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Biyoloji

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell sources due to their limitless self-renewal capabilities and their potential to differentiate into multiple cell types. The pluripotent state of hPSCs is typically assessed by techniques such as qPCR, immunocytochemistry, and by other in vitro and in vivo differentiation strategies into multiple cell types. Among these, immunocytochemical techniques have been developed for routine characterization of the undifferentiated state of hPSCs based on analysis of candidate intracellular and cell-surface biomarkers. Given the fact that hPSCs grow as colonies, problems arise in quantifying the expression of these markers at the individual cell level on a routine basis. Flow cytometry analyses serve to address this issue but require cell numbers and use of reagents that are not normally conducive for routine quality control assessment of hPSC cultures. Thus, the development of practical and reproducible means of creating monolayer cell samples with preserved integrity for marker evaluation has many advantages in stem cell research. This greatly benefits immunocytochemical analysis because individual cells from the monolayer can be easily observed and quantified for the expression of specific markers. Towards this goal, a self-made cytospin apparatus was constructed and optimized for use with immunocytochemical staining. Two cell-surface markers (SSEA3/SSEA4) expression were analyzed in a variant BG01 stem cell line for the purpose of this protocol.

Suspension immunocytochemical staining of human pluripotent stem cells (hPSCs) for cell-surface markers (SSEA-3/SSEA-4) was achieved based on use of a self-made cytospin apparatus to create a monolayer of cells for observation and quantification.

Self-Made sitospin Aparatı kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücre İmmünositokimyasal Analizi

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

Konfokal mikroskopi kullanılarak Yaşayan hücreler içinde endositik ve Sitosolik Bölümleri eşzamanlı pH Ölçümü

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...