Yazarlar, burada sunulan protokolün hazırlanmasının tüm aşamalarında verimli tartışmalar için tüm ACEnano konsorsiyumuna teşekkür eder. Yazarlar ayrıca ACEnano projesi çerçevesinde nº 720952 hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği Horizon 2020 Programı'ndan (H2020) fon sağlamayı takdir etmektedir.

1. AF4 sistem kurulumu
<ol><li>AF4 kartuşunu monte edin ve af4 sisteminin tüm donanım bileşenlerini ve UV-vis dedektörünü(Malzeme Masası)üretici kılavuzunda verilen talimatları izleyerek bağlayın.</li>
	<li>Üretici kılavuzunda verilen talimatları izleyerek kontrol, veri toplama, işleme ve değerlendirme için gerekli tüm yazılım paketlerini yükleyin.</li>
	<li>AF4 sistemi ile UV-vis dedektörü arasında gerekli tüm sinyal bağlantılarının kurulduğundan emin olun.</li>
	<li>Kurulu AF4-UV-vis bağlantılarının sıkı ve sızıntı olmadan olduğundan emin olun, kurulumu 15 dakika boyunca ultra saf su (UPW) ile yıkayın (uç akış hızı 1 mL⭐dk-1, odak akış hızı 1 mL⭐dk-1ve çapraz akış hızı 1,5 mL min-1). Bunu yapmak için AF4 kontrol yazılımını açın ve açılış sayfasının sağ üst tarafındaki ilgili panellere akış hızlarını girin. Gerekirse ilgili konektörleri (bağlantı parçaları) sıkın ve sızıntı gözlenemeyene kadar prosedürü tekrarlayın. NOT: Tüm ölçümler sırasında dahili sistem basıncı izlenmeli ve 4 ila 12 bar içinde olmalıdır. Basıncın daha yüksek veya daha düşük olması durumunda, geri basınç tüpünün ayarlanması gerekir. Ayrıca, kanal basıncı eğilimi tam ölçüm süresi boyunca sabit olmalıdır. NOT: Bir kanal fırını varsa, tüm AF4 denemeleri boyunca karşılaştırılabilir ölçüm koşulları sağlamak için sıcaklığını 25 °C olarak ayarlayın.</li>
</ol>2. AF4-UV-vis sistem kalifikasyonu ve numune analizi için çözeltilerin ve süspansiyonların hazırlanması
<ol><li>Temizleme çözümü<ol>
<li>1 L UPW'ye 8 g katı sodyum hidroksit (NaOH) ve 2 g sodyum dodecyl sülfat (SDS) ekleyin ve çözeltiyi tamamen çözünene kadar karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eluent<ol>
<li>Unu elde etmek için 2 L filtrelenmiş ve gazsız UPW'ye 500 μL filtrelenmiş yüzey aktif madde karışımı ekleyin (%0,025 (v/v), pH yaklaşık 9,4). NOT: Yüzey aktif madde karışımının bileşiklerinin ayrıntılı bir açıklaması Tablo 1'de (ayrıca Malzeme Tablosu) verilmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Toplu kurtarma belirleme için rastgele AuNP boyut standardı<ol>
<li>Vortex 2 dakika boyunca rastgele bir AuNP boyutu standardı (50 mg⭐L-1)ve 12.5 mg⭐L -1 nihai kütle konsantrasyonu elde etmek için UPW ile1:4seyreltin. Elde edilen süspansiyonu homojenize etmek için seyreltmeden sonra 2 dakika daha girdap. DİkKAT: Kimyasallarla, özellikle NaOH peletleriyle çalışırken gerekli ihtiyati tedbirler ve uygun koruyucu ekipman gereklidir. NOT: AF4-UV-vis-deneyleri sırasında düşük partikül arka planları sağlamak için genellikle 0,1 μm membran filtresi (hidrofilik PVDF veya benzeri) kullanarak gerekli tüm çözeltilerin (temizleme çözeltisi hariç) gazdan arındırılması ve filtrelenmeniz önerilir. Bu, özel bir vakum filtrasyon ünitesi veya şırınna filtreleri kullanılarak kurulabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. AF4-UV-vis sistem yeterliliği
<ol><li>Sistemi 30 dakika boyunca temizleme çözümüyle yıkamak için 1.4 adımında açıklanan yazılım ayarlarını kullanın (Uç akış hızı 1 mL⭐dk-1, Odak akış hızı 1 mL⭐min-1ve Çapraz akış hızı 1.5 mL⭐dk-1).</li>
	<li>İlgili yılan balığı şişesini değiştirin ve sistemi 20 dakika boyunca UPW ile yıkayın (Uç akış hızı 1 mL⭐dk-1, Odak akış hızı 1 mL⭐dk-1ve Çapraz akış hızı 1,5 mL⭐dk-1).</li>
	<li>İlgili satır içi pompa filtrelerini değiştirin.</li>
	<li>AF4 kartuşunu açın ve AF4 zarını değiştirin. AF4 kartuşunu yeniden bir araya alıp AF4-UV-vis sistemine yeniden bağlayın.</li>
	<li>Temizlenen AF4-UV-vis sistemini, membranı dengelemek ve sistemi stabilize etmek için en az 30 dakika boyunca elüent ile yıkayın (Uç akış hızı 1 mL⭐dk-1, Odak akış hızı 1 mL⭐dk-1ve Çapraz akış hızı 1,5 mL min-1). Olası sızıntıları tekrar denetleyin (bkz. adım 1.4).</li>
	<li>Rasgele bir AuNP boyutu standardı kullanarak kütle kurtarma ve tutma süresinin değişimini belirleyerek AF4-UV-vis sistemini niteleyebilirsiniz.<ol>
<li>Ayırma kuvveti uygulamadan doğrudan enjeksiyon çalışması gerçekleştirin.<ol>
<li>Dosya |'nı açarak yeni bir ölçüm dosyası oluşturma Yeni | AF4 kontrol yazılımında çalıştırın.</li>
			<li>Örnek ve ölçüm açıklamasının yanı sıra çalıştırma sekmesindeki ekleme hacmini ve örnek adını tanımlayın. Ölçüm koşulları Tablo 2'de görüntülenir.</li>
			<li>İkinci sekme FFF yöntemindeki ölçüm parametrelerini Tablo 2'ye göre ayarlayın.</li>
			<li>Ölçümü başlatmak için Çalıştır düğmesini tıklatın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ayırma kuvveti (Çapraz akış) uygulamasıyla kesirli bir çalışma gerçekleştirin.<ol>
<li>Tablo 3'tebelirtilen kesir koşullarını kullanarak önceki bölümde açıklandığı gibi kesir yöntemini tanımlayın.</li>
			<li>Ölçümü başlatmak için Çalıştır düğmesini tıklatın.</li>
			<li>Ölçümü dört katına çıkar. NOT: İlk çalıştırma sistemi (yani AF4 zarını) şartlandırmayı amaçlamaktadır ve sistem yeterlilik sonuçlarının nihai değerlendirmesinin dışında kalacaktır. NOT: Dosya |'i açarak oluşturulan tüm çalıştırma dosyalarını kaydetmeniz önerilir AF4 kontrol yazılımına kaydedin. </li>
			<li>Rasgele AuNP boyut standardı için >%80 toplu kurtarma ve tutma süresi <2% varyasyonu elde edilirse AF4-UV-vis-sisteminin nitelikli olduğunu düşünün.</li>
			<li>Enjeksiyon sistemi olarak bir otosampler kullanırken, optimum çalışma koşulları sağlamak için otomatik örnekleyicinin iğne yıkama rezervuar şişesini AF4-UV-vis sisteminden pompalanan çözeltiyle (örneğin, temizleme çözeltisi, UPW veya ilgili elüent) doldurun. Eluent değiştirilirken, genellikle UV-vis-dedektör sinyalini sabit bir seviyede sabit kalana kadar izleyerek AF4 sisteminin yeniden dengelenmesine uyulması önerilir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. AF4-UV-vis numune analizi
<ol><li>İlgili AuNP süspansiyonunu (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm, her 50 mg) girdaplayarak harici boyut kalibrasyonu için tüm AuNP boyut standartlarını hazırlayın. L-1) 2 dakika boyunca ve 12,5 mg⭐L -1 nihai kütle konsantrasyonu elde etmek için UPW ile1:4seyreltin. Elde edilen süspansiyonları homojenize etmek için seyreltmeden sonra 2 dakika daha girdap.</li>
	<li>Bilinmeyen AuNP örneğini, adım 4.1'de açıklanan kalibrasyon standartlarıyla aynı prosedürü uygulayarak analize hazırlayın.</li>
	<li>Tablo 2'degörüntülenen AF4 yöntemini kullanarak tüm AuNP boyut standartlarının doğrudan enjeksiyon ölçümünü gerçekleştirin.<ol>
<li>Bunu yapmak için, ayırma ve örnek parametreleri tanımlamak için uygun konumlarda üreticinin yazılımına Tablo 2'de özetlenen ilgili değerleri girin ve denemeyi başlatmak için Çalıştır düğmesine basın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Harici boyut kalibrasyon işlevini oluşturmak için Tablo 3'te görüntülenen AF4 yöntemini kullanarak her AuNP boyutu standardını ayrı ayrı kesirlendir.<ol>
<li>Tablo 3'te özetlenen ilgili değerleri uygun konumlarda üreticinin yazılımına girin. Kesirleme yöntemi bir odaklama adımı, birkaç elution adımı ve bir durulama adımı ile tanımlanır. Yöntemi ayarladıktan sonra, denemeyi başlatmak için Çalıştır düğmesine basın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tablo 2'degörüntülenen AF4 yöntemini kullanarak bilinmeyen AuNP örneğinin doğrudan enjeksiyon ölçümünü gerçekleştirin.</li>
	<li>Tablo 3'te listelenen AF4 yöntemini yürüterek bilinmeyen AuNP örneğinin kesirlemesini gerçekleştirin.</li>
	<li>Anlamlı ve istatistiksel olarak ilgili sonuçlar elde etmek için aksi belirtilmedikçe Bölüm 3 ve 4'te belirtilen tüm ölçümleri üç taraflı olarak gerçekleştirin.<ol>
<li>Kullanmadan önce 50 mg⭐L-1 AuNP stok süspansiyonlarını 4–8 °C'de saklayın. Seyreltilmiş AuNP süspansiyonlar uygulamadan önce 30 dakika içinde ideal olarak hazırlanır. NOT: Girdap genellikle yeterlidir ve süspansiyonların ultrasonikasyonu gerekli değildir.</li>
		<li>Bilinmeyen AuNP örneğinin saklama süresinin AuNP boyut standartları için elde edilen saklama süreleriyle ilişkilendirilmesini sağlamak için, aynı AF4 yöntemini kullanarak tüm örnekleri ölçün. NOT: Sabit ve geçerli ayırma koşullarını sağlamak için, sistem yeterlilik bölümünde açıklanan kesir adımını (bkz. adım 3.6.2) tanımlanmış sayıda örnek ölçümden (ör. 10 ölçüm) sonra ekleyin/tekrarlayın. Buna ek olarak, kayıt sistemi basıncı ve UV-vis dedektör taban çizgisi stabilitesi. Tam bir AF4-UV-vis çalıştırması boyunca sabit ve sabit kalmalıdırlar. NOT: Genellikle, UV-vis dedektörü (veya varsa Çok Açılı Işık Saçılma (MALS) dedektörü) artan bir gürültü seviyesi gösterdiğinde veya kurtarma, numune tepe şekli veya tekrarlanabilirlik gibi tanımlanmış sistem yeterlilik kriterleri kaçırıldığında (veya AF4-UV-vis-sistemi kapsamlı bir temizleme prosedürüne tabi tutulduğunda) ultrafiltrasyon membranını değiştirin. Burada açıklanan koşullar altında, nitelikli AF4-UV-vis sistemi genellikle aynı membran kullanılarak en az 50 ölçüm için kararlıdır; ancak, tanımlanan kalite kriterlerini karşılayan olası ardışık ölçümlerin sayısı numune, numune matrisi ve elüent bileşimine bağlı olarak önemli ölçüde değişebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Veri değerlendirmesi
<ol><li>Af4-UV-vis sistem üreticisi tarafından sağlanan veri değerlendirme yazılımını veya üretici kılavuzunda verilen talimatları izleyerek ilgili veri toplama yazılımından gerekli tüm ham verilerin (yani UV-vis tepe alanı) dışa aktarılmasından sonra elektronik tablo analizini kullanarak toplu kurtarma hesaplamasını gerçekleştirin.<ol>
<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak kesir ölçümünün (Afraksiyonasyonu)ve doğrudan enjeksiyon ölçümünün(Doğrudan enjeksiyon)ilgili UV-vis tepeleri altındaki alanları karşılaştırarak AuNP kütle geri kazanımını hesaplayın: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ02.jpg"> NOT: Doğrudan enjeksiyon ölçümü sırasında ayırma kuvveti uygulanmaz ve bu nedenle bir analit türünün biriktirme duvarı ile potansiyel etkileşimleri ihmal edilebilir. İlgili bir UV-vis zirvesi altındaki alan, örnekteki başka hiçbir türün ilgili dalga boyunda emilmeyeceği ve/veya i) fraksiyonasyon koşulları altında başka bir tutma zamanında elutes ii) AF4 zarı aracılığıyla çıkarıldığı varsayılarak Bira-Lambert yasası kullanılarak AuNP kütlesi ile doğrudan ilişkilendirilebilir.</li>
		<li>Hem doğrudan ekleme hem de kesirleme çalıştırmasından elde edilen dat.</li>
		<li>Genel Bakış sekmesinde UV-vis dedektör izlemesini seçin.</li>
		<li>Tüm ölçümler için sinyal ve taban çizgisi görünümünde bir İlgi Alanı (YG) ve bir taban çizgisi tanımlayın.</li>
		<li>Insert ile Doğrudan Enjeksiyon Kalibrasyonu takın.</li>
		<li>Doğrudan Enjeksiyon Kalibrasyon Ayarları görünümünde tüm doğrudan enjeksiyon çalıştırmalarını seçin ve bir UV yok olma katsayısı girin. NOT: Hem kalibrasyon hem de fraksiyon ölçümü için aynı UV-vis yok olma katsayısının kullanılması önemlidir.</li>
		<li>Yatırım getirisi içindeki UV-vis sinyal izlemesi altındaki alanı ve girilen konsantrasyondan ve enjeksiyon hacminden hesaplanan enjekte edilen miktarı kullanarak kalibrasyon hattını kurun. Elde edilen kalibrasyon ayrı Doğrudan Enjeksiyon Kalibrasyon İşlevi penceresinde gösterilecektir.</li>
		<li>Kalibrasyon işlevini ilgili kesir ölçümlerine atayın. NOT: Her kalibrasyon boyutu standardı ve bilinmeyen AuNP numunesi için, AuNP'nin boyuta bağlı UV-vis absorbansı nedeniyle ayrı bir kalibrasyon fonksiyonu kurulması gerekir. UV-vis dedektörünün bu dezavantajı, ICP-MS gibi kütleye duyarlı bir dedektör kullanılarak atlatılabilir.</li>
		<li>Nicel Sonuçlar hesaplaması ekleyerek analizleri gerçekleştirin ve sonuçlar sağdaki bir tabloda konsantrasyon ve enjekte edilen miktar değerleri olarak görüntülenir.</li>
	</ol></li>
	<li>Af4 sistem üreticisi tarafından sağlanan veri değerlendirme yazılımını veya gerekli tüm ham verilerin (örneğin, AuNP kalibrasyon standartlarının ilgili UV-vis peak maxima ve ilgili boşluk sürelerinde saklama süreleri) üretici kılavuzunda verilen talimatları izleyerek ilgili veri toplama yazılımından dışa aktarılmasından sonra elektronik tablo analizini kullanarak saklama süresinin varyasyonunu hesaplayın.<ol>
<li>İçe aktarılan tüm ölçümler için ilgili UV izlemelerini görüntülemek üzere Genel Bakış penceresini açın.</li>
		<li>Pik algılama otomatik olarak gerçekleştirilecektir; performansı optimize etmek için sinyal işleme araç kutusundaki tepe algılama parametrelerini ayarlayın. Tüm ölçüm dosyalarını gözden geçirerek ilgili tepe maxima'yı ayıklayın.</li>
		<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak tüm ölçümler için göreli standart sapması hesaplayın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ01.jpg"> Hesaplama, ilgili bir elektronik tablo yazılımı kullanılarak da gerçekleştirilebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Üretici kılavuzunda verilen talimatları izleyerek ilgili veri toplama yazılımından gerekli tüm ham verilerin (UV-vis tepe maksimum analit ve ilgili boşluk süresinde saklama süresi) dışa aktarmasından sonra üretici tarafından sağlanan veri değerlendirme yazılımını veya elektronik tablo analizini kullanarak boyut belirleme gerçekleştirin. Daha önce yapılan DLS ölçümlerinden elde edilen hidrodinamik boyutlarına karşı AuNP boyut standartlarının (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) boşluk süresi düzeltilmiş saklama süreleri (net saklama süreleri, bkz. Tablo 5)çizilerek harici bir boyut kalibrasyon fonksiyonu oluşturulabilir (bkz. Tablo 4). NOT: DLS ölçümleri, karşılaştırılabilir numune özelliklerini sağlamak için ilgili kesir ölçümleriyle aynı gün ideal olarak yapılmalıdır.<ol>
<li>.dat dosyaları içe aktarıldıktan sonra tüm ölçümler Genel Bakış sekmesinde görüntülenir. Kaplama penceresinin altında görüntülenen dedektörler listesinden UV-vis dedektör sinyalini seçin. Her ölçüm için Sinyal ve Taban Çizgisi görünümünde ayarlanabilen bir yatırım getirisi ve taban çizgisi tanımlayın. Gürültülü sinyalleri yumuşatmak için sağdaki Sinyal işleme araç kutusunu kullanın. Parametrelerin sırasıyla sinyaller gibi diğer ölçümlere ayrılmasına izin vermek için İşleme Parametrelerini Diğer Çalıştırmalara Ata işlevini kullanın.</li>
		<li>Ekle sekmesinden Parçacık Boyutu Kalibrasyonu'nun öğesini seçin. </li>
		<li>Sağ üst taraftaki Kalibrasyon referanslarını seç tablosundaki ilgili ölçüme tıklayarak tüm kalibrasyon çalıştırmalarını seçin. Seçilen tüm ölçümler aşağıdaki tabloda görüntülenecektir. Tablo 4'tebelirtilen tüm kalibrasyon ölçümleri için hidrodinamik yarıçapı girin. İşlev Parçacık boyutu kalibrasyonu – fonksiyon penceresinde görüntülenecek ve denklem de gösterilecektir. NOT: Kurulan boyut kalibrasyon fonksiyonunun korelasyon katsayısı (R2)0,990 ≥ olmalıdır.</li>
		<li>Atama için Çalıştırmaları Seç listesindeki ilgili kesirleri seçerek kalibrasyon işlevini bilinmeyen AuNP örneğinin ölçümlerine atayın.</li>
		<li>Ekleme sekmesinde parçacık boyutu dağıtım hesaplaması açarak sonuçları görüntüleyin. Daha önce oluşturulan parçacık boyutu kalibrasyonu, sağ pencere ayarlarındagörüntülenen bilinmeyen AuNP numune ölçümleri için Kalibrasyon olarak listelenir. Hesaplanan boyut, en tepeye etiketlenmiş boyut dağıtım penceresinde gösterilir. Bir örneğin tüm ölçümlerini ortalamak ve sonucu en yüksek maksimum etikette listelemek için Örnek için Ortalama Sinyaller onay kutusunu seçin.</li>
		<li>Ayrıca, Kalibrasyon eğrisini göster onay kutusunu seçerek kalibrasyon çizgisini fraktogramın üzerine çizin. Kümülatif dağılım göster onay kutusu seçilerek bir kümülatif boyut dağılımı kullanılabilir. NOT: Veri değerlendirmesi için üreticinin yazılımını kullanırken, Ekle sekmesinin içindeki Rapor'a tıklayarak oluşturulabilecek tüm sonuçların bir rapora eklenmesi önerilir. Rapor düğmesi belgeye tüm sonuçları, tabloları ve diyagramları ekler. Rapor sekmesinin altında, Rapor kurulumu Belge bölümünde açılarak rapor ayarları değiştirilebilir.</li>
	</ol></li>
</ol>

Bu makalenin tüm yazarları, ürünleri bu protokolde kullanılan Postnova Analytics GmbH çalışanlarıdır.

Bilinmeyen bir AuNP'nin hidrodinamik boyutu, AF4 tarafından 20 nm ila 100 nm arasında iyi tanımlanmış AuNP boyut standartları kullanılarak bir UV-vis dedektörü ile birlikte doğru bir şekilde değerlendirildi. Geliştirilen AF4 yöntemi, ölçülen tutma süresi ile AuNP boyutu arasında doğrusal bir ilişki kurmak için sabit bir çapraz akış profili kullanılarak optimize edildi ve böylece doğrusal regresyon analizinden basit bir boyut belirlemesi sağladı. Özellikle odak noktası, fraksiyonasyon sırasında önemli bir numune kaybı olmadığını gösteren yeterince yüksek geri kazanım oranları elde etmek ve uygulanan yılan balığı ve membran da dahil olmak üzere geliştirilen AF4 yönteminin tüm fraksiyone edilmiş AuNP örnekleriyle iyi eşleşmesiydi.
Yöntem geliştirme, AF4'teki tartışmasız en kritik adımdır ve belirli bir elüasyon süresi penceresinde fraksiyonasyonu iyileştirmek için kanal boyutları, akış parametrelerinin yanı sıra atık su, membran, ara parça yüksekliği ve hatta örnek özellikleri de dahil olmak üzere çeşitli parametrelerin dikkate alınması gerekir. Bu paragrafın amacı, burada tartışılan bilinmeyen AuNP örneğinin boyutunu başarıyla belirlemek için en iyi duruma getirilmiş kritik adımlarda okuyucuya rehberlik etmektir. Genellikle bir AF4 yönteminin nasıl geliştirileceği hakkında daha ayrıntılı bir açıklama için, okuyucu 'ISO/ TS21362:2018 - Nanoteknolojiler - Asimetrik akış ve santrifüj alan akışı fraksiyonasyonu kullanılarak nano nesnelerin analizi'25'inAF4 bölümüne atıfta bulunulmaktadır. Tablo 3'te verilen uygulanan fraksiyonasyon koşullarına daha yakından bakmak , ilk kritik adım AF4 kanalındaki AuNP örneğinin tanıtılması ve gevşemesidir. Bu adım, etkileşimi örneği membran yüzeyine yakın bulmaya ve temelde fraksiyonun başlangıç noktasını tanımlayan AF4 kanalının enjeksiyon portuna yakın dar bir bantta konsantre etmeye zorlayan enjeksiyon akışı, odak akışı ve çapraz akış tarafından yönetilir. Bu adım sırasında, farklı boyutlardaki örnek bileşenlerin AF4 kanalının farklı yüksekliklerinde bulunması ve böylece başarılı bir boyut fraksiyonasyonu için temel oluşturması nedeniyle numunenin yeterli bir şekilde gevşetilmesi zorunludur. Tamamlanmamış numune gevşemesi genellikle boyanmamış (yani rahat olmayan) örnek bileşenlerden kaynaklanan artan bir boşluk tepe alanı ile görülebilir. Bu etki enjeksiyon süresi ve/veya uygulanan çapraz akış hızı artırılarak azaltılabilir. Bununla birlikte, her iki parametre de özellikle AF4 membranına aglomerasyon ve adsorpsiyona eğilimli numuneler için dikkatli optimizasyona ihtiyaç duyar ve farklı parametre ayarları36,37için elde edilen ilgili kurtarma oranları ile izlenebilir. 5 dakikalık uygulanan enjeksiyon süresi ve 1,0 mL⭐dk-1 çapraz akış hızı, tüm AuNP örnekleri için geri kazanım oranlarını >%80 ve neredeyse optimum gevşeme koşullarını gösteren ihmal edilebilir bir boşluk tepe alanını ortaya çıkardı. AuNP örneğinin yeterli gevşemesinin ardından odak akışı durduruldu ve AF4 kanal uzunluğu boyunca ikinci kritik adımı temsil eden ilgili UV-vis dedektörüne numune taşınması başlatıldı. Makul analiz sürelerinde yeterince yüksek fraksiyonasyon gücü sağlamak için, 30-50 dakika boyunca (ilgili fraksiyone AuNP boyut standardına bağlı olarak) 1,0 mL/dk-1 sabit çapraz akış hızı ve ardından 0,5 mL.dk -1 dedektör akış hızında10 dk doğrusal çapraz akış bozunması uygulanmıştır. Tüm AuNP boyut standartlarının ayrımı boyunca sabit bir çapraz akış profili kullanmak, FFF-teorisi22'yitakiben tutma süresi ile AuNP boyutu arasında doğrusal bir ilişki ortaya çıkardı, böylece bilinmeyen AuNP örneğinin basit doğrusal regresyon analizi ile boyut belirlemesini sağladı. Bununla birlikte, sabit bir çapraz akış dışındaki profiller de nanopartiküllerin boyutlandırılması için sömürülmüştür ve sonuçta tutma süresi ile parçacık boyutu38,39arasında doğrusal olmayan bir ilişkiye yol açmaktadır. Ek olarak, AF4'te iyi tanımlanmış boyut standartları kullanılarak boyut belirleme AuNP ile sınırlı değildir, ancak diğer boyutlarda ve element bileşiminde (örneğin, gümüş38, 40 veya silika nanopartiküller41,42)nanopartiküllere de uygulanabilir. Ek olarak, seyreltilmiş numunelerle çalışırken, ICP-MS, AF4 ile birleşebilen ve süspansiyondaki çok çeşitli nanopartiküllerin boyutlandırılması için bu analitik yaklaşımın çok yönlülüğüne katkıda bulunan son derece hassas bir elementel dedektördür.
Yaygın uygulamasına rağmen, AF4'te iyi tanımlanmış boyut standartları kullanılarak dış boyut kalibrasyonu, bilinmeyen numunelerin doğru boyutlandırılması için kullanırken dikkate alınması gereken bazı özelliklere sahiptir. Her şeyden önce, büyük ölçüde ilgili boyut standartlarının ve gerçek numunenin fraksiyonasyonu sırasında karşılaştırılabilir koşulların uygulanmasına dayanır. Burada sunulan durumda, hem AuNP boyut standartlarının hem de bilinmeyen AuNP örneğinin aynı AF4 yönteminin yanı sıra aynı eluent ve aynı membranın bu yaklaşımı oldukça esnek olmayan hale getirmesi zorunludur. Ayrıca, örneğin hafif saçılma (MALS ve DLS) gibi boyuta duyarlı dedektörler olmadan, boyut standartlarını kullanan ilgili bir AF4 yönteminin yeterince iyi çalışıp çalışmadığını belirlemek zordur. Bu, özellikle çok geniş boyutlu dağılımlar sergileyen bilinmeyen örnekler için geçerlidir, burada tüm örnek bileşenlerin normal elution desenini izleyip izlemediği belirsizliğini korur: daha küçük parçacıklardan daha büyük parçacıklara fraksiyonasyon veya daha büyük örnek bileşenlerin sterik-hiperlayer modunda zaten elute olup olmadığı ve böylece potansiyel olarak daha küçük örnek bileşenleri43,44ile birlikte elde edilip edilmediği. Buna ek olarak, FFF-teorisi AF4'ü sadece hidrodinamik boyuttaki farklılıklara dayanarak ayırdığını ve parçacıkların çevreleriyle herhangi bir etkileşimde bulunmadan nokta kütleleri olarak kabul edildiğini vurgulasa da22, gerçeklik parçacık-parçacık ve parçacık-mem ile farklı bir hikaye anlatır beyin etkileşimleri (elektrostatik çekim/itme veya van-der-Waals cazibesi gibi) önemli bir rol oynayabilir ve harici boyut kalibrasyonu45,46aracılığıyla boyut belirlemelerine ölçülebilir bir önyargı getirebilir. Bu nedenle, ilgi çekici parçacığın bileşimine ve yüzey özelliklerine (Zeta potansiyeli) ideal olarak uyan boyut standartlarının kullanılması önerilir40,42 veya, bunlar mevcut değilse, en azından iyi karakterize edilmiş partikül boyutu standartlarını (örneğin, polistiren lateks parçacıklar) kullanın ve özellikle analizinyapılacağıilgili ortamdaki yüzey Zeta potansiyeli açısından ilgi parçacıkları ile karşılaştırılılabilirliklerini dikkatlice değerlendirin.
AF4'ün çok yönlülüğü genellikle en büyük gücü olarak kabul edilir, çünkü bu alandaki diğer yaygın boyutlandırma tekniklerinin çoğunun ötesine geçen bir uygulama aralığı sunar22,48,49. Aynı zamanda, ilişkili muhtemel karmaşıklığı nedeniyle, özellikle DLS, Nanopartikül İzleme Analizi veya tek parçacıklı ICP-MS gibi hızlı ve görünürde kullanımı kolay boyutlandırma tekniklerine karşı en önemli dezavantajı olarak da kabul edilebilir. Bununla birlikte, AF4'ü bu popüler boyutlandırma teknikleri ile perspektife koyarken, tüm tekniklerin artıları ve eksileri olduğu açıktır, ancak hepsi nanopartiküllerin fiziko-kimyasal doğasının daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunur ve bu nedenle rekabetçi değil tamamlayıcı olarak kabul edilmelidir.
Burada sunulan standart çalışma prosedürü (SÇP), BILINMEYEN bir AuNP örneğinin süspansiyonda boyutlandırılması için harici boyut kalibrasyonu ile AF4-UV-vis'in mükemmel uygulanabilirliğini vurgular ve sonunda Horizon 2020 projesi ACEnano (bu ILC'nin sonucu gelecekteki bir yayına konu olacaktır) çerçevesinde yürütülen uluslararası bir detaylandırma karşılaştırması (ILC) içinde bilinmeyen bir AuNP örneğinin AF4 analizi için önerilen bir kılavuz olarak uygulanmıştır. Bu nedenle, bu protokol, AF4'ün nanopartikül karakterizasyonu alanındaki umut verici potansiyelinin altını çizen AF4 metodolojileri25,50,51,52'yi doğrulamak ve standartlaştırmak için teşvik edici ve devam eden uluslararası çabalara katkıda bulunur.

Kolloidal altın şeklindeki altın nanopartiküller (AuNP), nanopartiküllerin ne olduğu konusunda bir anlayış olmadan çok önce ve nanopartikül terimi çağdaş, bilimsel kelime hazinesine girmeden çok önce insan kültürünün bir parçasıydı. Nano ölçekli görünümleri hakkında farklı bir bilgi olmadan, askıya alınan AuNP, V-VI yüzyıllar MÖ1'deantik Çin, Arabistan ve Hindistan'da tıbbi ve diğer amaçlar için zaten kullanılmıştır ve ayrıca eski Romalılar, British Museum2'dekiLycurgus Cup sergisinde çömleklerini ünlü bir şekilde lekelemek için yakut kırmızı renklerinden yararlanmışlardı. Batı dünyasında, Orta Çağ'dan Modern Çağ'a kadar yüzyıllar boyunca, askıya alınan AuNP ağırlıklı olarak cam ve emaye (Cassius Moru)3 için renklendirici ajanlar olarak ve ayrıca frengi4başta olmak üzere çeşitli hastalıkları (İçilebilir Altın) tedavi etmek için kullanılmıştır.
Bununla birlikte, tüm bu çalışmalar öncelikle askıya alınmış AuNP uygulamasına odaklanmıştı ve oluşumlarını, doğalarını ve özelliklerini araştırmak için ilk rasyonel yaklaşımı tanıtmak 1857'de Michael Faraday'a bağlıydı5. Faraday, bu AuNP'nin çok dakika boyutlarına sahip olması gerektiğinin zaten farkında olmasına rağmen, boyut dağılımları hakkında açık bilgilereerişilebilen 6,7, sonunda boyut ve diğer AuNP özellikleri arasındaki korelasyonu sağlayan elektron mikroskopisinin geliştirilmesine kadar değildi.
Günümüzde, oldukça kolay ve basit sentezleri, dikkat çekici optik özellikleri (yüzey plazmon rezonansı), iyi kimyasal stabilitesi ve dolayısıyla küçük toksisiteleri ve mevcut boyutlar ve yüzey modifikasyonları açısından yüksek çok yönlülükleri sayesinde, AuNP nanoelektronik8,teşhis9,kanser tedavisi10veya ilaç teslimi11gibi alanlarda yaygın uygulamalar bulmuştur. Açıkçası, bu uygulamalar için, uygulanan AuNP'nin boyut ve boyut dağılımı hakkında kesin bilgi, optimum etkinlik12'yi sağlamak için temel bir ön koşuldur ve bu önemli fiziko-kimyasal parametreyi belirlemek için sağlam ve güvenilir araçlara önemli bir talep vardır. Bugün, aunp'yi süspansiyonda boyutlandırabilen çok sayıda analitik teknik vardır. örneğin, UV-vis Spektroskopisi (UV-vis)13, Dinamik Işık Saçılımı (DLS)14 veya Tek Parçacık Endüktif Olarak Eşleştirilmiş Plazma Kütle Spektrometresi (spICP-MS)15 ile Alan Akış Fraksiyonasyonu (FFF) bu alanda önemli bir oyuncu16,17,18,19,20.
İlk olarak 1966 yılında J. Calvin Giddings21tarafından kavramsallaştırılan FFF, ayırmanın sabit bir faz 22,23olmadan ince, kurdele benzeri bir kanalda gerçekleştiği, elution tabanlı fraksiyonasyon teknikleri bir aileden oluşur. FFF'de ayırma, bir numunenin laminer kanal akışının yönüne dik hareket eden bir dış kuvvet alanıyla etkileşimi ile indüklenen, numunenin genellikle ilgili satır içi dedektörlere doğru aşağı doğru taşındığı yerdir. Bu ilgili FFF teknikleri arasında, ikinci bir akışın (çapraz akış) kuvvet alanı olarak işlev gördüğü Asimetrik Akış Alanı-Akış Fraksiyonasyonu (AF4), en yaygın kullanılan alt tip24 halinegelmiştir. AF4'te, kanal tabanı (biriktirme duvarı), çapraz akışın membrandan geçmesine ve ekstra bir çıkış yoluyla kanaldan ayrılmasına izin verirken numuneyi koruyabilen yarı geçirgen bir ultrafiltrasyon membranı ile donatılmıştır. Bu sayede çapraz akış, numuneyi biriktirme duvarına doğru itebilir ve böylece difüzyon kaynaklı akısına (Brownian hareketi) karşı koyabilir. Alan ve difüzyon kaynaklı akıların ortaya çıkan dengesinde; daha yüksek difüzyon katsayıları sergileyen daha küçük numune bileşenleri kanal merkezine daha yakın hizalanırken, daha düşük difüzyon katsayıları sergileyen daha büyük numune bileşenleri biriktirme duvarına daha yakın bulunur. Kanalın içindeki parabolik akış profili nedeniyle, daha küçük numune bileşenleri bu nedenle kanal akışının daha hızlı laminasında taşınır ve daha büyük numune bileşenlerinden önce elüte edilir. FFF tutma parametresi ve Stokes-Einstein difüzyon katsayısı denklemleri kullanılarak, AF4'teki bir örneğin elüasyon süresi ve sırasıyla elüasyon hacmi doğrudan hidrodinamik boyutuna çevrilebilir22. Burada açıklanan elution davranışı normal elution modunu ifade eder ve genellikle AF4 için yaklaşık 1-500 nm (bazen parçacık özelliklerine ve fraksiyonasyon parametrelerine bağlı olarak 2000 nm'ye kadar) arasında bir parçacık boyutu aralığında geçerlidir, oysa sterik-hiperlayer elution genellikle bu boyuteşiğinin üzerinde gerçekleşir 25.
FFF tarafından ayrıldıktan sonra boyut bilgilerini türetmenin üç yaygın yolu vardır. FFF modüler bir cihaz olduğundan, ek şekil bilgileri elde etmek için Çok Açılı Işık Saçılma (MALS)26 , 27, Dinamik Işık Saçılma (DLS)28,29ve hatta her ikisinin bir kombinasyonuna dayanan boyuta duyarlı ışık saçılma dedektörleri gibi birden fazla dedektörle aşağı akışta birleştirilebilir 30,31. Bununla birlikte, bir örneğin FFF kanalındaki tutma davranışı genellikle iyi tanımlanmış fiziksel kuvvetler tarafından yönetildiği için, boyut, basit bir konsantrasyon dedektörünün (örneğin, bir UV-vis dedektörü)32 , 33.
Üçüncü bir seçenek olarak,burada,UV-vis algılaması ile birlikte AF4 kullanılarak süspansiyonda bilinmeyen bir altın nanopartikül örneğinin boyutlandırılması için 20-100 nm boyut aralığında iyi tanımlanmış AuNP standartları kullanılarak harici boyut kalibrasyonu 34,35 uygulamasını rapor ediyoruz. Bu basit deneysel kurulum, daha sonra burada sunulan protokole dayanarak Avrupa Birliği Horizon 2020 projesi ACEnano çerçevesinde gerçekleştirilen uluslararası bir detay karşılaştırmasına (ILC) mümkün olduğunca çok laboratuvarın katılmasına izin vermek için bilerek seçildi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m Membrane Filters (hydrophilic PVDF)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-FIL-TEF-002</td>
			<td>Used for filtration of aqueous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m PVDF Syringe Filter (d = 33 mm)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Durapore Millex</td>
			<td>Used for filtration of NovaChem100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Volume Pipettes (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Research Plus</td>
			<td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF4 cartridge</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>AF2000 MF - AF4 Analytical Channel</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-AF4-MEM-612-10KD</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance (0.1 mg precision)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ENTRIS124I-1S</td>
			<td>Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN5300</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel Oven</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN4020</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossflow Module</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>AF2000 MF Control Module</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>ep T.I.P.S</td>
			<td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks (e.g. 2 liter volume)</td>
			<td>neoLab</td>
			<td>1-0199</td>
			<td>Used for eluent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Pump</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN1131</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>VIA-002</td>
			<td>Used for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaCal Gold</td>
			<td>50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>VIBRAX-VXR</td>
			<td>Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal Computer (PC)</td>
			<td>Dell Technologies</td>
			<td>/</td>
			<td>Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.)</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>In accordance with respective laboratory&#8217;s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-VIA-09150868</td>
			<td>Used for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), &#8805;99 %, Blotting Grade</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>2326.1</td>
			<td>Used for the preparation of the cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, &#8805;98 %, p.a</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>Used for the preparation of the cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for Control and Data Acquisition</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaFFF AF2000 Software</td>
			<td>Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for Data Evaluation</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaAnalysis Software</td>
			<td>Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for final Data Processing</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Origin 2019</td>
			<td>Used for final data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Degasser</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7520</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Selector</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7310</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Organizer</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7140</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant Mixture</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaChem100</td>
			<td>Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pump</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN1130</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unknown AuNP sample</td>
			<td>BBI Solutions</td>
			<td>EM.GC60</td>
			<td>60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-vis Detector</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN3211</td>
			<td>UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration Unit</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Eluent Filtration System</td>
			<td>Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Used for homogenization of diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Milli-Q Integral 5</td>
			<td>Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 M&#937;cm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

asymmetrical flow field-flow fractionation for sizing of gold nanoparticles in suspension

Parçacık boyutu, nanopartikül kavramı ile ilişkili tartışmasız en önemli fiziko-kimyasal parametredir. Nanopartiküllerin boyut ve boyut dağılımı hakkında kesin bilgi, çeşitli uygulamalar için son derece önemlidir. Boyut aralığı, nanopartikül dozunun en "aktif" bileşenini tanımladığı için de önemlidir.
Asimetrik Akış Alanı-Akış Fraksiyonasyonu (AF4), süspansiyondaki parçacıkların yaklaşık 1–1000 nm boyut aralığında boyutlandırılması için güçlü bir tekniktir. Bir AF4 deneyinden boyut bilgisi elde etmenin birkaç yolu vardır. AF4'ü Çok Açılı Işık Saçılma veya Dinamik Işık Saçılma ilkelerine dayanan boyuta duyarlı dedektörlerle çevrimiçi olarak bağlamanın yanı sıra, iyi kurulmuş bir teorik yaklaşım (FFF teorisi) kullanarak veya iyi tanımlanmış parçacık boyutu standartlarının (harici boyut kalibrasyonu) tutma süreleriyle karşılaştırarak bir numunenin boyutunu tutma süresiyle ilişkilendirme imkanı da vardır.
Burada, bilinmeyen bir altın nanopartikül örneğinin AF4 tarafından boyutlandırılması için standart bir işletim prosedürünün (SÇP) geliştirilmesini ve şirket içinde doğrulanmasını ve 20-100 nm boyut aralığında altın nanopartikül standartlarına sahip harici boyut kalibrasyonu kullanılarak UV-vis tespiti ile birleştiğinde açıklanmaktadır. Bu prosedür, numune hazırlama, AF4 enstrüman kurulumu ve kalifikasyonu, AF4 yöntemi geliştirme ve bilinmeyen altın nanopartikül örneğinin fraksiyonasyonu ve elde edilen sonuçların yerleşik dış boyut kalibrasyonu ile korelasyonu dahil olmak üzere geliştirilen iş akışının ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Burada açıklanan SÇP, süspansiyondaki nanopartikül örneklerinin boyutlandırılması için AF4'ün mükemmel sağlamlığını ve güvenilirliğini vurgulayan bir detaylandırma karşılaştırma çalışması çerçevesinde başarıyla doğrulandı.

İlk olarak, AuNP boyut standartları AF4 ile kesirlendi ve 532 nm dalga boyunda (AuNP'nin yüzey plazmon rezonansı) AuNP'nin emiciliğini ölçen UV-vis ile tespit edildi. Elde edilen fraktogramların yer paylaşımı Şekil 1'desunulmuştur. Her AuNP'nin triplikat ölçümlerinden elde edilen ilgili UV-vis tepe maksimumunda tutma süreleri Tablo 5'telistelenmiştir. Tüm saklama sürelerinin göreli standart sapması, artan boyutla azalan ölçüm farkı ile % 1,1'in altındaydı. Genel olarak, mükemmel bir tekrarlanabilirlik elde edildi. Elution süresi ve hidrodinamik boyutun doğrusal bir ilişkisi ile sonuçlanan sabit bir ayırma kuvveti uygulandı. Dış boyut kalibrasyon hattı, belirtilen hidrodinamik yarıçapın, düzeltilen boş işleme süresine (net tutma süresi) karşı çizilmesiyle kurulmuştur. Doğrusal regresyon analizi, a = -3.373 nm ± 1.716 nm ve eğim b = 1.209 nm⭐dk-1 ± 0.055 nm min-1ile doğrusal kalibrasyon fonksiyonu ile sonuçlandı. Elution'ın doğrusal davranışı 0.9958'in kare korelasyon katsayısı R2 ile doğrulandı. İlgili kalibrasyon fonksiyonu Şekil 2'degörsel olarak görüntülenir.
İkinci bölümde bilinmeyen AuNP örneğinin analizi ele alındı. Protokol bölümünde(bölüm 4.2)açıklanan prosedüre göre numunenin üç aliquots hazırlandı. Üç aliquot'un her biri, AuNP boyut standartları için de uygulanan aynı AF4 fraksiyonasyon yöntemi kullanılarak üç taraflı olarak araştırılmıştır. Bilinmeyen AuNP örneğinin elde edilen dokuz AF4-UV-vis fraktogramının tümü Şekil 3'te sunulmuştur ve ilgili değerlendirmeleri Tablo 6'daözetlenmiştir. İlgili saklama sürelerinin göreli standart sapması önemli ölçüde düşüktü ve% 0.1 ile% 0.5 arasında değişiyordu. AuNP boyut standartlarının kesirlenmesinden elde edilen parçacık boyutu kalibrasyon fonksiyonu kullanılarak ve UV-vis tepe maksimumda bilinmeyen AuNP örneğinin elde edilen tutma süreleriyle ilişkilendirilerek, 29,4 nm ± 0,2 nm'lik genel ortalama bir hidrodinamik yarıçap hesaplanabilir. Ayrıca, AuNP örneğinin önemli bir aglomera veya çözünmesi veya parçacıkların membran yüzeyine önemli ölçüde adsorpsiyonu olmadığını gösteren% 83.1 ±% 1.2'lik makul bir kütle geri kazanımı elde edildi. Şekil 4, elde edilen parçacık boyutu dağılımını, uygulanan AF4 yönteminin mükemmel sağlamlığını vurgulayan ortalama dokuz UV-vis sinyal izinin tümüyle görüntüler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig01.jpg"> Şekil 1: Normalleştirilmiş sinyal yoğunlukları ve uygulanan sabit çapraz akış hızı (siyah çizgi) ile dört ayrı AuNP boyut kalibrasyon standardının triplikat analizinden elde edilen AF4-UV-vis fraktogramlar. Boşluk zirvesi yaklaşık 5,9 dk'da gri renkle <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig01large.jpg" target="_blank">vurgulanır.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig02.jpg"> Şekil 2: DLS ölçümlerinin ilgili standart sapmalarından (Tablo 4) elde edilen hata çubukları ve elde edilen AF4 saklama sürelerindeki farklılıklar (Tablo 5) dahil olmak üzere, belirtilen hidrodinamik yarıçapı her bir AuNP boyut kalibrasyon standardının tutma süresine göre çizildikten sonra elde edilen harici boyut kalibrasyon fonksiyonu. Doğrusal regresyon analizinden y = a + bx, = -3.373 nm ± 1.716 nm ve b = 1.209 nm·dk-1 ± 0.055 nm·dk-1 şeklinde standart hatalar içeren doğrusal kalibrasyon fonksiyonu hesaplanmıştır. Doğrusal bir ilişkiyi gösteren R2 = 0.9958 ile kare korelasyon katsayısı belirlendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig03.jpg"> Şekil 3: Bilinmeyen AuNP'yi gösteren üç aliquot'un üç taraflı ölçümlerinin AF4-UV-vis fraktogramları. Ölçüm süresi boyunca uygulanan sabit çapraz akış hızı siyah bir çizgi olarak gösterilmiştir. Yaklaşık 5,9 dakikadaki boşluk zirvesi gri renkle vurgulanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig04.jpg"> Şekil 4: Bilinmeyen AuNP örneğinin elde edilen ortalama partikül boyutu dağılımının (kırmızı) ve uygulanan doğrusal kalibrasyon işlevinin (noktalı çizgi) yer paylaşımı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Bileşen</td>
			<td>CAS-Hayır</td>
			<td>Ağırlık (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Su</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>88.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">9-Oktandesnoik asit (Z)-, bileşik ile 2,2',2''-nitrilotris[etanol](1:1)</td>
			<td>2717-15-9</td>
			<td>3.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Sodyum karbonat</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>2.7</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Alkoller, C12-14-sekonder, etoksilatlı</td>
			<td>84133-50-6</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tetrasosyum EDTA</td>
			<td>64-02-8</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Polietilen glikol</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Sodyum oleat</td>
			<td>143-19-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Sodyum bikarbonat</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Eluent hazırlamak için kullanılan yüzey aktif madde karışımının bileşenlerinin listesi (ayrıca bkz. Malzeme Tablosu).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>AF4-UV-vis parametreleri</td>
			<td>Birim</td>
			<td>Değer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aralayıcı kalınlığı</td>
			<td>Μm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dedektör akış hızı</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çapraz akış hızı</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0 (8 dakika sabit)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Odak akış hızı</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gecikme süresi / stabilizasyon süresi</td>
			<td>Dk</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enjeksiyon akış hızı</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geçiş zamanı</td>
			<td>Dk</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enjeksiyon süresi</td>
			<td>Dk</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elution adımı</td>
			<td>Dk</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Durulama adım süresi</td>
			<td>Dk</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adım akış hızını durula</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enjeksiyon hacmi</td>
			<td>μL</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Numune konsantrasyonu</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Membran tipi</td>
			<td></td>
			<td>Rejenere selüloz</td>
		</tr>
<tr>
<td>Membran moleküler ağırlık kesme</td>
			<td>Kartal</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluent</td>
			<td></td>
			<td>%0,025 (v/v) yüzey aktif madde karışımı</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-vis dalga boyu</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-vis hassasiyeti</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Bir ayırma kuvveti uygulamadan doğrudan enjeksiyon çalışmasını gerçekleştirmek için AF4-UV-vis fraksiyonasyon yöntemi parametrelerinin özeti.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>AF4-UV-vis parametreleri</td>
			<td>Birim</td>
			<td>Değer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aralayıcı kalınlığı</td>
			<td>Μm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dedektör akış hızı</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çapraz akış hızı</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>1 (60 dk sabit, 10 dk doğrusal)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Odak akış hızı</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gecikme süresi / stabilizasyon süresi</td>
			<td>Dk</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enjeksiyon akış hızı</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geçiş zamanı</td>
			<td>Dk</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enjeksiyon süresi</td>
			<td>Dk</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elution adımı</td>
			<td>Dk</td>
			<td>70 (60 dk sabit, 10 dk doğrusal)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Durulama adımı</td>
			<td>Dk</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adım akış hızını durula</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enjeksiyon hacmi</td>
			<td>μL</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Numune konsantrasyonu</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Membran tipi</td>
			<td></td>
			<td>Rejenere selüloz</td>
		</tr>
<tr>
<td>Membran moleküler ağırlık kesme</td>
			<td>Kartal</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluent</td>
			<td></td>
			<td>%0,025 (v/v) yüzey aktif madde karışımı</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-vis dalga boyu</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-vis hassasiyeti</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Kesirleme çalışmasını ayırma kuvveti olarak çapraz akış uygulamasıyla gerçekleştirmek için AF4-UV-vis fraksiyonasyon yöntemi parametrelerinin özeti.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kalibrasyon standardı</td>
			<td>Kapatma aracısı</td>
			<td>Ortalama Boyut (TEM) (nm)</td>
			<td>CV (ortalama boyut TEM) (%)</td>
			<td>Zeta potansiyeli (mV)</td>
			<td>SD (zeta potansiyeli) (mV)</td>
			<td>Hidrodinamik Yarıçap (DLS) (nm)</td>
			<td>SD (hidrodinamik yarıçap) (nm)</td>
			<td>Pdı</td>
			<td>SD (PDI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 20 nm</td>
			<td>Sitrat</td>
			<td>20.1</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-48.9</td>
			<td>1.5</td>
			<td>10.95</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.082</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 40 nm</td>
			<td>Sitrat</td>
			<td>40.8</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-30.4</td>
			<td>1.0</td>
			<td>20.30</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.127</td>
			<td>0.006</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 80 nm</td>
			<td>Sitrat</td>
			<td>79.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-51.5</td>
			<td>1.3</td>
			<td>38.85</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.138</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 100 nm</td>
			<td>Sitrat</td>
			<td>102.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-50.9</td>
			<td>0.9</td>
			<td>52.30</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.078</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 4: Kapaklama maddesi, TEM ortalama boyutu, yerel süspansiyonda belirlenen Zeta potansiyeli ve sıvıda belirlenen DLS hidrodinamik yarıçapı ve polidispersite indeksi (PDI) dahil olmak üzere uygulanan AuNP kalibrasyon standartlarının fiziko-kimyasal parametrelerinin özeti.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kalibrasyon standardı</td>
			<td>Çalıştırmak</td>
			<td>En yüksek maksimumda saklama süresi (min)</td>
			<td>En yüksek (min) net saklama süresi</td>
			<td>Ortalama net saklama süresi (min)</td>
			<td>SD (%) (net saklama süresi)</td>
			<td>SD (min) (net saklama süresi)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 20 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>17.368</td>
			<td>11.468</td>
			<td rowspan="3">11.56</td>
			<td rowspan="3">1.02</td>
			<td rowspan="3">0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>17.409</td>
			<td>11.509</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>17.589</td>
			<td>11.689</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 40 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>25.316</td>
			<td>19.416</td>
			<td rowspan="3">19.49</td>
			<td rowspan="3">0.68</td>
			<td rowspan="3">0.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>25.32</td>
			<td>19.42</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>25.548</td>
			<td>19.648</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 80 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>42.095</td>
			<td>36.195</td>
			<td rowspan="3">36.29</td>
			<td rowspan="3">0.23</td>
			<td rowspan="3">0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>42.219</td>
			<td>36.319</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>42.257</td>
			<td>36.357</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 100 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>50.975</td>
			<td>45.075</td>
			<td rowspan="3">45.06</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50.924</td>
			<td>45.024</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50.986</td>
			<td>45.086</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 5: AuNP kalibrasyon standartlarının, Tablo 3'teaçıklanan yöntem kullanılarak ilgili AF4-UV-vis fraktogramlardan elde edilen ilgili UV-Vis zirvesindeki tutma süreleri maksimum.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Aliquote</td>
			<td>Çalıştırmak</td>
			<td>Saklama süresi en yüksek (min)</td>
			<td>En yüksek maksimumda ortalama saklama süresi (min)</td>
			<td>En yüksek (min) net saklama süresi</td>
			<td>SD (%) saklama süresi</td>
			<td>Hidrodinamik yarıçap (nm)</td>
			<td>Kurtarma (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>1</td>
			<td>32.689</td>
			<td rowspan="3">32.70</td>
			<td>26.789</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">29.03</td>
			<td rowspan="3">85.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>32.687</td>
			<td>26.787</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>32.719</td>
			<td>26.819</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">2</td>
			<td>1</td>
			<td>32.989</td>
			<td rowspan="3">33.08</td>
			<td>27.089</td>
			<td rowspan="3">0.37</td>
			<td rowspan="3">29.49</td>
			<td rowspan="3">81.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.073</td>
			<td>27.173</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.187</td>
			<td>27.287</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.053</td>
			<td rowspan="3">33.14</td>
			<td>27.153</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">29.56</td>
			<td rowspan="3">82.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.071</td>
			<td>27.171</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.291</td>
			<td>27.391</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 6: İlgili UV-Vis tepe maksimumundaki tutma sürelerinin özeti, dış boyut kalibrasyonundan hesaplanan hidrodinamik yarıçap (Şekil 2) ve AF4-UV-vis analizinden elde edilen bilinmeyen AuNP örneğinin geri kazanım oranı.

Watch this Scientific Journal Video about Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension at JoVE.com

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Bu protokol, bilinmeyen bir altın nanopartikül örneğinin boyutunun belirlenmesi için UV-vis algılaması ile birlikte Asimetrik Akış Alanı Akış Fraksiyonu'nun kullanımını açıklar.

Süspansiyonda Altın Nanopartiküllerin Boyutlandırılması için Asimetrik Akış Alanı-Akış Fraksiyonasyonu

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

asymmetrical-flow-field-flow-fractionation-for-sizing-gold

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.0K Görüntüleme.  Postnova Analytics GmbH. Bu protokol, bilinmeyen bir altın nanopartikül örneğinin boyutunun belirlenmesi için UV-vis algılaması ile birlikte Asimetrik Akış Alanı Akış Fraksiyonu'nun kullanımını açıklar.

Video: Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

Biyolojik Sistemleri İyon Konsantrasyon Ölçümü için Floresan Nanopartiküller

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Biyomühendislik

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

Hücre-malzeme Etkileşim Araştırmalar Nanogözenekli Altın Patterns mikroimalat

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation nanoparticles (HNPs). The latter are a new family of probes recently introduced for labeling biological samples for multi-photon imaging. HNPs are capable of doubling the frequency of excitation light by the nonlinear optical process of second harmonic generation with no restriction on the excitation wavelength.
Multi-photon based methodologies for hESC differentiation into cardiac clusters (maintained as long term air-liquid cultures) are presented in detail. In particular, evidence on how to maximize the intense second harmonic (SH) emission of isolated HNPs during 3D monitoring of beating cardiac tissue in 3D is shown. The analysis of the resulting images to retrieve 3D displacement patterns is also detailed.

Protocol details are provided for in vitro labeling human embryonic stem cells with second harmonic generating nanoparticles. Methodologies for hESC investigation by multi-photon microscopy and their differentiation into cardiac clusters are also presented.

Rejeneratif Araştırma harmonik nanopartiküller

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Parametrized Diyastolik Dolum Biçimcilik yoluyla Transmitral Akışının Modellenmesi Kinematik tabanlı Analizi ile Küresel Diyastolik Fonksiyonu Kantitasyonu

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Sıvılardaki Darbeli Lazer-Ablasyonuyla Metal Nanopartikül Üretimi: Nanopartiküllerin Antibakteriyel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Alet

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a cell-penetrating peptide, TAT, for intracellular delivery. However, TAT has shown non-specific biological activities. Gold nanoparticles (GNPs) can be used as drug delivery carriers without recognized toxicity. Therefore, we have used a GNP/peptide hybrid to deliver PKC&#948;i. Two short peptides (P2: CAAAAE and P4: CAAAAW), at a 95:5 ratio, were used to modify the surface properties of GNP. GNPs conjugated with PKC&#948;i (GNP/PKCi) are stable in distilled water, 0.9% NaCl, and phosphate-buffered saline (PBS) containing bovine serum albumin or fetal bovine serum. Intravenous injection of GNP-PKCi was previously shown to prevent ischemia-reperfusion injury of the lung. This article outlines a protocol to formulate GNP/PKCi and assess the physiochemical properties of GNP/PKCi. We have used similar methods to formulate other peptide-based drugs with GNP. This article will hopefully draw more attention to this novel intracellular drug delivery technology and its applications in vivo.

We have previously used a gold nanoparticle peptide hybrid to intravenously deliver a synthetic peptide, protein kinase C-delta inhibitor, which reduced ischemia-reperfusion-induced acute lung injury. Here we show the detailed protocol of the drug formulation. Other intracellular peptides can be formulated similarly.

Protein kinaz C-delta inhibitör peptid formülasyonu altın nano tanecikleri kullanarak

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Hidrofobik ve hidrofilik bileşikler polimer nano tanecikleri Kapsülleme için NanoPrecipitation flash

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...