Bu in vitro, 96 iyi plaka tabanlı protokol, antikorların Candida biyofilmlerinde mantar hücrelerinin metabolik aktivitesi üzerindeki yeni antifungal ajanlar üzerindeki inhibitör etkisini test etmek için kullanılabilir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu, antikorların veya antifungallerin Candida biyofilmlerinin gelişimi üzerindeki etkisini değerlendirmek için oldukça hassas, doğru, yüksek verimli, tekrarlanabilir, kullanıcı dostu ve uygun maliyetli bir tekniktir. Bu test, yeni ilaç bazlı veya antikor bazlı terapötiklerin ve ayrıca invaziv kandidiyazisin şiddeti ile ilişkili Candida biyofilmlerine karşı aşı adaylarının etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.
Bu yöntem, biyofilm oluşumu veya olgunlaşması sırasında yeni antifungal ajanların veya antikorların farklı mantar suşları veya antikor kaynakları kullanılarak farklı ortamlarda etkisini test etmek için uygulanabilir. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımda çalışan bir doktora araştırma görevlisi olan Bay Pankaj Chandley olacaktır. Başlamak için, 96 kuyucuklu bir mikrotitre plakasına 100 mikrolitre Candida tropicalis kültürü ekleyin.
Çok kanallı pipet kullanarak son iki sütunu yalnızca 100 mikrolitre RPMI 1640 MOPS ortamıyla doldurun. Mikrotitre plakasını bir kapak ve alüminyum folyo ile örtün ve plakayı sabit koşullar altında 37 santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, çok kanallı bir pipet kullanarak ortamı dikkatlice aspire edin.
Plakayı hafifçe lekeleme tabakaları üzerinde ters çevirin ve artık ortamları çıkarmak için dokunun. Plakayı çok kanallı pipet kullanarak 200 mikrolitre 1X PBS ile yıkayın. Çok kanallı pipet kullanarak PBS'yi dikkatlice aspire edin ve PBS ile iki kez yıkayın.
Fazla PBS'yi çıkarmak için, plakayı biyolojik bir güvenlik kabini içindeki oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hava ile kurulayın. Isı etkisiyle inaktive edilmiş serum örneklerinin seri seyreltilerini steril RPMI 1640 MOPS ortamında hazırlayın. 96 delikli mikrotitre plakasının her bir kuyucuğuna seçilen serum seyreltmesinin 100 mikrolitresini ekleyin.
Sütun 10'da, yalnızca mantar pozitif kontrolü için yalnızca RPMI 1640 MOPS ortamı ekleyin. Mantarsız artı serum negatif kontrolü olarak hizmet etmek için sütun 11'deki tüm kuyucuklara bir ila 50 serum seyreltmesi ekleyin. Plakayı bir kapak ve alüminyum folyo ile kapladıktan sonra, plakayı 37 santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin.
Ertesi gün, çok kanallı bir pipet kullanarak serumu dikkatlice aspire ettikten sonra, kalan serumu çıkarmak için ters çevrilmiş plakaya hafifçe dokunun. PBS yıkamayı üç kez tekrarlayın ve fazla PBS'yi kurutmak için plakayı biyolojik bir güvenlik dolabı içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hava ile kurulayın. Daha sonra, 25 miligram XTT'yi 50 mililitre filtre sterilize edilmiş Ringer laktatında çözün.
Ayrı tüplerde Aliquot 10 mililitre. Alüminyum folyo ile örtün ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, 8.6 miligram menadionu beş mililitre asetonda çözün.
Ve 50 mikrolitreyi 100 ayrı mikro tüpte dağıttıktan sonra, alikotları eksi 80 santigrat derecede saklayın. 10 mililitre XTT alın ve bir mikromolar çalışma çözeltisi elde etmek için bir mikrolitre menadion ekleyin. 96 delikli mikrotitre plakasının kuyucuğu başına 100 mikrolitre XTT menadion çözeltisi ekleyin.
Daha sonra, plakayı bir kapak ve alüminyum folyo ile kapladıktan sonra, plakayı karanlıkta 37 santigrat derecede iki saat boyunca inkübe edin. Son olarak, her bir kuyucuktan 80 mikrolitre renkli süpernatantı taze bir 96 delikli plakaya aktarın ve plakayı 490 nanometrede okuyun. Sap2-parapsilazis-bağışıklanmış farelerden elde edilen serum, önceden oluşturulmuş Candida tropicalis biyofilmlerinin olgunlaşmasını önleyebilir, Sap2-albicans'tan alınan serumda% 45 ve Sap2-tropicalis ile aşılanmış farelerde% 55 karşılaştırıldığında.
Genel olarak, Sap2 immün serumu tarafından biyofilm inhibisyonu, immün öncesi serumda% 16 ve% 13 olan sahte immün serumdan anlamlı derecede daha yüksekti. Biyofilm inhibisyonu PBS kullanımında ihmal edilebilir düzeydeydi ve serum kontrolü yoktu. Biyofilmlerin bozulmasını önlemek için yıkama adımları uygulanırken azami özen gösterilmelidir.
XTT çözeltisi kullanımdan hemen önce hazırlanmalı ve hemen plakaya eklenmelidir. Bu prosedürü takiben, kullanıcılar farklı mantar suşları kullanarak farklı araştırma ortamlarında Candida biyofilm oluşumu ve olgunlaşması sırasında yeni antifungal ajanların, aşı adaylarının veya antikorların etkisini değerlendirebilirler.
