SB, SM ve DM, CNRS, Inserm ve Aix-Marseille Üniversitesi'nden kurumsal fonlar ve Fransız Ulusal Araştırma Ajansı'ndan (ANR-17-CE15-0032-01 ve ANR-18-CE15-0021-02) ve Fransız "Investissement d'Avenir" (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM) program hibeleriyle desteklenmiştir. KW, Biyoteknoloji ve Nanoteknoloji alanında BİLİNEN disiplinlerarası çevre doktora çalışmaları programı olan "BioTechNan" ı kabul etmektedir. EB, Polonya Ulusal Bilim Merkezi'nin (NCN) 2016/21/D/NZ1/00285 proje no'lu proje kapsamında Fransız Hükümeti ve Polonya'daki Fransa Büyükelçiliği'nin mali desteğini kabul eder. MŁ, Polonya Kalkınma Bakanlığı'nın (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) ve Ulusal Araştırma ve Geliştirme Merkezi'nin (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17) mali desteğini kabul eder. TT, Polonya Ulusal Bilim Merkezi'nden (NCN) 2016/21/B/NZ3/00343 proje no'lu proje kapsamında ve Wroclaw Biyoteknoloji Merkezi'nden (KNOW) mali destek aldığını kabul etmektedir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Burada, svFCS modülünün standart bir floresan mikroskop üzerinde uygulanmasını, FCS difüzyon yasası analizi sayesinde canlı hücrelerdeki plazma membran organizasyonunun dinamiklerini deşifre etmek için güçlü bir deneysel yaklaşımı açıkladık. Kavramsal olarak, svFCS basit bir ilkeye dayanmaktadır: aydınlatma alanının boyutunu değiştirirken zaman alanındaki floresanın korelasyon ölçümleri23. Bu strateji, mikroskobik ölçümlerden nanoskopik bilgi çıkarmada etkili olmuştur, bu da plazma zarı organizasyonuna kararlı halde 25 ve fizyolojik süreçlerde 30,31,32,33'te katkıda bulunan ana fizikokimyasal elementlerin deşifre edilmesine yardımcı olmaktadır. Toplamda, bu svFCS analizleri, çeşitli hücre tiplerinde lipite bağımlı nanodomainlerin varlığını ve farklı sinyal olaylarının ayarlanmasında doğrudan etkilerini açıkça göstermektedir.
Bu çerçevede, foton bütçesini optimize etmek ve optik sapmaları en aza indirmek için svFCS kurulumunu oluştururken göz önünde bulundurulması gereken bazı optik hususlar vardır. Bu nedenle, svFCS ölçümü yapıldığında tüp lensin çıkarılabileceği bir mikroskop kullanmanızı öneririz. Dahası, tek bir iris, svFCS kurulumunda önemli bir rol oynar: hedefin arka açıklığındaki ışın boyutunu değiştirir, böylece etkili bel boyutunu (yani etkili uyarma hacmini) doğrudan değiştirir. Kiriş çapı, en küçük bel boyutu34'ü elde etmek için objektif arka göz bebeğine uymalıdır. Bel ölçüsünün ayarlanmasına yardımcı olan bu seçenek, foton bütçesinin optimizasyonunu sağlar ve uygulanması kolaydır. Son olarak, ışık yolu boyunca minimum sayıda optik parça kullanılır; sistem ne kadar az karmaşık olursa, kaybolan fotonlar o kadar az olur. Tüm bu seçenekler svFCS deneylerinin sağlamlığını önemli ölçüde artırır.
Protokolün kendisi ile ilgili olarak, birkaç kritik adım göz önünde bulundurulmalıdır. En önemlisi, başarılı svFCS ölçümleri için çok önemli olan optik yolların uygun bir şekilde hizalanmasıdır (protokol, bölüm 2). 300 μW lazer aydınlatma altında ~ 200 kHz olması gereken 2 nM Rh6G çözeltisinden gelen floresan sinyalini analiz ederek bunu kontrol etmek kolaydır. Tüm süsenler açılmalı ve ACF'ler önemli bir genliğe sahip olmalıdır (tipik olarak G0 ~ 1.5-2.0). Bir diğer kritik nokta ise hücreler ve bunların svFCS analizine hazırlanması ile ilgilidir (protokol, bölüm 4-8). Yoğunlukları, gözlemlenecek izole hücrelerin analiz için mevcut olması için uyarlanmalıdır. Yapışkan olmayan hücreler, poli-L-lizin çözeltisi kullanılarak odacıklı bir kapak camı üzerinde hareketsiz hale getirilmelidir. Hücre etiketlemesinden gelen floresan sinyali çok güçlü olmamalıdır, aksi takdirde sığması zor olan çok düz ACF'lere neden olur ve uyum parametreleri önemli bir hatayla yüklenir. Ek olarak, hücrelerdeki homojen olmayan etiketleme ve floresan agregaları, svFCS ölçümlerinin yorumlanmasını son derece zorlaştırır. Son olarak, kolesterol oksidaz tedavisi hücre canlılığını etkiler ve svFCS analizi tedaviden bir saat sonra geçmemelidir. Desteğe bağlı olmadığı için üst plazma zarından floresan dalgalanmalarını kaydetmek de daha iyidir ve destekle fiziksel etkileşimler nedeniyle moleküllerin difüzyonunun engellenmesi riski yoktur.
svFCS tekniğinde, algılama hacmini ayarlamak için kullanılan yöntemlerin çeşitliliği nedeniyle farklı yaklaşımlarda kullanımı için yeterli ilerleme kaydedilmiştir ve bu da canlı hücrelerdeki çeşitli biyolojik süreçleri incelemeyi mümkün kılmaktadır. Uyarma hacminin boyutunu ayarlamaya bir alternatif, değişken bir ışın genişletici35 kullanmaktır. Plazma zarının z yönü36 boyunca kesişmesinden gelen floresan sinyalini kaydederek aydınlatma alanının boyutunu modüle etmek de mümkündür. Bu, difüzyon yasası37,38'i türetmek için teorik bir çerçevenin geliştirildiği standart bir konfokal mikroskopta yapılabilir.
svFCS yöntemi, plazma zarının homojen olmayan yanal organizasyonunun karakterizasyonu için gerekli olan mekansal-zamansal çözünürlük sunsa da, geometrik hapsetme modları birbirini dışlamaz. Bir yönde veya diğerinde t0'lık bir sapma, yalnızca baskın bir hapsetme modunu ortaya çıkarır25. Ayrıca, mevcut svFCS yönteminin bir diğer önemli sınırlaması, klasik optik kırınım sınırından (~ 200 nm) kaynaklanmaktadır. Bu, hücre plazma zarı içindeki molekülleri sınırlayan alanlardan tartışmasız daha büyüktür. Bu nedenle, hapsedilmenin analizi, difüzyon yasasından çıkarılan t0 değerinden çıkarılır.
Bu dezavantaj, alternatif yöntemler uygulanarak aşılmıştır. Başlangıçta, nanodiyaframlarla delinmiş metalik filmlerin kullanılması, çok küçük bir membran alanını aydınlatma imkanı sundu (yani, 75 ila 250 nm arasında değişen yarıçaplı tek nanometrik açıklıkların optik kırınım sınırının altında)39. İzole etki alanı organizasyonu için teorik difüzyon yasasından öngörülen geçiş rejimi böylece rapor edildi ve nanometrik membran heterojenitelerinin karakteristik boyutunun iyileştirilmesine ve lipit bağımlı nanodomainler tarafından işgal edilen yüzey alanının nicel bir tahminine izin verdi39. Alternatif olarak, nanometrik aydınlatma, yakın alan taramalı optik mikroskopi40 veya düzlemsel optik nanoantenler41 kullanılarak da geliştirilmiştir. Daha yakın zamanlarda, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) ve FCS'yi birleştirmek, difüzyon yasasını çok yüksek uzamsal çözünürlükle belgelemek için güçlü ve hassas bir araç sağlamıştır. Bu STED-FCS, kısa bir süre içinde meydana gelen nano ölçekte moleküler difüzyon özelliklerine erişim sağlar ve plazma zarı42,43'teki lipit problarının dinamik organizasyonunun incelenmesine izin verir. Bununla birlikte, STED prosesinde floresanın eksik baskılanması, FCS'deki oto-korelasyon eğrilerinin analizini zorlaştırmaktadır.
Bu zorluğun üstesinden gelmek, difüzyon sürelerinin ve ortalama molekül sayısı ölçümlerinin doğruluğunu artırmak için yeni bir montaj modeli geliştirilmiştir44. Son olarak, plazma zarında yavaş moleküler difüzyon için, svFCS prensibi görüntü korelasyon spektroskopisi45 ile kaydedilen verilere uygulanabilir. Son zamanlarda, atomik kuvvet mikroskobunun (AFM) görüntüleme toplam iç yansıması-FCS (ITIR-FCS) ile birleştirilmesinin, plazma zarında moleküler difüzyonu engelleyen mekanizmanın doğasının iyileştirilmesine katkıda bulunduğu, özellikle de nanodomainlerin yüksek yoğunluğu nedeniyle perkolasyon eşiği membran konfigürasyonunun yakınında46 olduğu gösterilmiştir.
Sonuç olarak, svFCS tarafından difüzyon yasasının oluşturulması, dinamik kolektif lipitler ve membran proteinlerinin ilişkilerinin yarattığı yerel heterojenliği çıkarmak için deneysel kanıtlar sağlamıştır. Wohland ve iş arkadaşları46 tarafından belirtildiği gibi, "FCS difüzyon yasası analizi, dinamik bilgilerden çözünürlük sınırının altındaki yapısal ve organizasyonel özellikleri çıkarmak için değerli bir araç olmaya devam etmektedir". Yine de, plazma zarında meydana gelen moleküler olayların dinamiklerinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacak difüzyon yasasının yorumlanmasını iyileştirmek için yeni modeller geliştirmemiz gerekiyor.

Plazma membran organizasyonunun karmaşıklığı Hücre zarı organizasyonunun mevcut anlayışı birkaç yönü dikkate almalıdır1. İlk olarak, karmaşık bir lipit bileşimi sadece hücre tipleri arasında değil, aynı zamanda tek bir hücre içinde (membran organelleri / plazma zarı) da değişir. Ayrıca, ilişkili veya içsel membran proteinleri çoğunlukla dinamik multimerik komplekslerde organize edilir, büyük alanlar membranın dışına uzanır ve tek başına transmembran alanlarından önemli ölçüde daha büyük bir alanı oluşturur. Ayrıca, membranla ilişkili proteinler, protein fonksiyonunun düzenlenmesinde rol oynayan spesifik lipit bağlayıcı veya lipit etkileşimi kapasiteleri sergiler. Bunlar doğrudan lipitlerin yerel bileşimine ve erişilebilirliğine bağlıdır2.
Son olarak, membran proteinlerinin içsel asimetrik yapısı ve lipitlerin dağılımı nedeniyle iki membran broşürü arasında önemli düzeyde asimetri gözlenmektedir. Gerçekten de, sentez ve hidroliz arasındaki lipit metabolik dengesi, broşürler arasındaki lipit flip-flop ile birleştiğinde, böyle asimetrik bir dağılım oluşturur. Çift katmanlı herhangi bir taşıma, kutupsal kafa grubunu membranların hidrofobik iç kısmından hareket ettirmek için gereken serbest enerji tarafından kısıtlandığından, genellikle seçici taşıyıcılar tarafından desteklenir. Her hücre tipi için, asimetri sıkıca korunma eğilimindedir. Toplamda, bu faktörler plazma membranının lateral homojensizliğine veya bölümlenmesine katkıda bulunur 3,4.
Plazma zarının bu temsilini, çift katmanın içinde ve boyunca içsel moleküler difüzyonu dikkate alarak zenginleştiriyoruz, bu da dinamik yanal heterojenliğe onda biri ila yüzlerce nanometre ve mikrosaniyeler ila saniyeler arasında bir ölçekte katkıda bulunuyor. Örneğin, lipite bağımlı membran nanodomainleri - kolesterol olarak tanımlanan lipit salları ve sfingolipid bakımından zengin sinyal platformları - plazma zarının bölümlenmesine katkıda bulunur 5,6. Bununla birlikte, membran organizasyonunun mevcut görünümü sadece lipit salları ile sınırlı değildir. Membran nanodomainleri bileşim, köken ve fonksiyon bakımından daha karmaşık ve heterojendir. Yine de, plazma zarındaki varlıkları sıkı bir şekilde koordine edilmelidir ve proteinler ve lipitler arasındaki dinamik etkileşimler, membran nanoalanlarınınmekansal dağılımında ve kimyasal modifikasyonunda önemli görünmektedir 1,3,7,8.
svFCS prensibi ve plazma membranının organizasyonunu araştırmak için uygulanması Membran alanlarının analizinde, esas olarak biyofiziksel tekniklerle çok ilerleme kaydedilmiş olmasına rağmen, plazma zarının yerel organizasyonunu belirleyen determinantların uygun mekansal ve zamansal çözünürlükle rafine edilmesi gerekir. Tek tek molekülleri izlemeye dayanan determinantlar, mükemmel uzamsal hassasiyet sağlar ve farklı hareket modlarınınkarakterizasyonuna izin verir 9,10,11,12, ancak klasik düşük kamera kare hızlarıyla sınırlı bir zamansal çözünürlüğe sahiptir ve önemli sayıda yörüngeyi kaydetmek için daha fazla deneysel çaba gerektirir. Alternatif olarak, membran bileşenlerinin difüzyon katsayısı, Fotobeyazlatma Sonrası Floresan Geri Kazanımı (FRAP)13 veya Floresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS)14 ile değerlendirilebilir. İkincisi, esas olarak yüksek hassasiyeti ve seçiciliği, mikroskobik algılama hacmi, düşük invazivliği ve geniş dinamik aralığı15 nedeniyle daha fazla dikkat çekmiştir.
FCS'nin kavramsal temeli, Magde ve meslektaşları tarafından yaklaşık 50 yıl önce16,17 tanıtıldı. Floresan emisyonunun dalgalanmasının yüksek zamansal çözünürlükle (μs'den s'ye)18 kaydedilmesine dayanır. Modern versiyonunda, canlı hücrelerdeki ölçümler, bir ilgi alanına (örneğin, plazma zarında) yerleştirilmiş küçük bir konfokal uyarma hacmi (~ 0.3 femtolitre) ile gerçekleştirilir; Gözlem hacmine giren ve çıkan floresan moleküllerinin yayılmasıyla üretilen floresan sinyali, çok yüksek zamansal çözünürlükle (yani, her fotonun dedektöre varış zamanı) toplanır. Daha sonra, sinyal, bir molekülün odak hacmi içinde kaldığı ortalama td (difüzyon süresi), ACF'nin genliği ile ters orantılı olan gözlem hacminde bulunan ortalama parçacık sayısı (N) ile birlikte çıkarıldığı otokorelasyon fonksiyonunu (ACF) üretmek için hesaplanır. Bu son parametre, gözlem hacmi içindeki molekül konsantrasyonu hakkında yararlı bilgiler olabilir.
O zamandan beri, biyofotonikte hızla gelişen enstrümantasyon sayesinde giderek artan sayıda FCS modalitesi uygulanmakta ve canlı sistemlerde meydana gelen dinamik olayların tanımlanmasına izin verilmektedir. Yine de, moleküler bir tür, genellikle moleküllerin19. zamanda doğrusal olmayan bir ilişkiyle yayıldığı anormal bir difüzyon karakteristiği tarafından yansıtılan difüzyon katsayısı değerlerinin daha örtüşen bir dağılımını ve bu anormal subdifüzyonun biyolojik anlamını tanımlamada zorluk çekecektir. Geçmişte, bu zorluk, FRAP tarafından moleküler difüzyonun sadece bir alandan değil, çeşitli boyutlardaki alanlardan kaydedilmesiyle bir şekilde aşılmış ve böylece ek mekansal bilgi sağlanmıştır. Bu, örneğin, membran mikrodomainleri20,21,22'nin kavramsallaştırılmasını sağladı.
Bu stratejinin FCS ölçümlerine çevirisi (yani, spot varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi (svFCS)), gözlemin odak hacminin boyutunu değiştirerek floresandaki dalgalanmanın farklı uzamsal ölçeklerde kaydedilmesine izin vererek kurulmuştur23. Bu nedenle, svFCS yaklaşımı, incelenen moleküllerin moleküler difüzyon modlarının ve membran bölümleme tipinin (izole ve bitişik alanlar24) tanımlanmasına ve belirlenmesine izin veren dolaylı mekansal bilgi sağlar. Difüzyon süresi td'yi, bu durumda23,25 numaralı algılama ışını yarıçapı boyutuna karşılık gelen bel (ω) değeri tarafından tanımlanan çeşitli uzamsal ölçeklerin bir fonksiyonu olarak çizerek, belirli bir fizyolojik durumda belirli bir molekülün difüzyon yasasını karakterize edebilir. Bu nedenle svFCS, zaman alanı26'da tek parçacık izlemenin mükemmel bir analogudur. Brownian difüzyon kısıtlaması altında, difüzyon zamanı td ile bel ω arasında kesinlikle doğrusal bir ilişki beklenmelidir (Şekil 1)23,25. Difüzyon yasasının bu şemadan sapmasının kökeni, sitoiskelet ağı, moleküler kalabalıklaşma, nanodomainlerde dinamik bölümleme veya bunların ve diğer etkilerin herhangi bir kombinasyonu gibi münhasır olmayan nedenlere bağlanabilir (Şekil 1) ve deneysel olarak test edilmesi gerekir25.
Burada, sıfırdan inşa edilmiş özel yapım bir svFCS optik sisteminin günlük kullanımı için gerekli tüm kontrol noktalarını sağlıyoruz, bu da bu deneysel yaklaşımla ilgili önceki protokol incelemelerimiz27,28'i tamamlıyor. Ayrıca, kavramın bir kanıtı olarak, kurulumun kalibrasyonu, hücrelerin hazırlanması, veri toplama ve lipid-sal nanodomainlerinde lokalize olduğu bilinen bir plazma zarı glikozilfosfatidilinositol ile implante edilmiş bir protein olan Thy1-GFP için svFCS difüzyon yasasının (DL) oluşturulması için analiz ile ilgili kılavuzlar veriyoruz29. Son olarak, kolesterol oksidaz tedavisi ile lipid-sal nanodomainlerinin kısmi destabilizasyonunun Thy1-GFP'nin difüzyon özelliklerini nasıl etkilediğini gösteriyoruz. Ek olarak, sıfırdan bir svFCS kurulumu oluşturmanın ayrıntılı bir açıklaması Ek materyalde verilmiştir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aligment tool</td>
			<td>Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SPW602</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM)</td>
			<td>Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>SPCM-AQRH-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BNC 50 &#937; plug to 50 &#937; plug lead 2 m</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>742-4315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 &#937; With connector, 1.22 m, RoHS2</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>885-8172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Tee 50&#937; RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 &#8594; 1GHz</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>546-4948</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E &#8211; French Extension Lead, 230 V</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>768-5500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>452-8394</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>792-4079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filtering</td>
			<td>535/70 ET Bandpass, AOI 0&#176; Chroma Diameter 25 mm</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F47-539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45&#176; Chroma 25.5 x 36 x 1 mm</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F43-088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0&#176; Chroma Diameter 25</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F37-496</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware correlator</td>
			<td>80 MHz Digital Correlator</td>
			<td>Correlator.com</td>
			<td>Flex02-12D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW</td>
			<td>Lasos</td>
			<td>BLD-XT 488100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety</td>
			<td>High-Performance Black Masking Tape, 1&#34; x 180&#39; (25 mm x 55 m) Roll</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T743-2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MC-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG3B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope 
			Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS 
			(D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>421767-9971-711</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adapter W0.8 / M27x0.75 H &#34;5&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1698-345</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Middle ring W0.8 - W0.8 H &#34;5&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1698-347</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical path</td>
			<td>D25.4mm Mirror, Protected Silver</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25 &#181;m mounted pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P25S I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPH10M-488 (HWP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RSP1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100B/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adjustable Prism Clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM3/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Beam block - active area 19 mm x 38 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LB1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ID25/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100CL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1&#34; Optic Holder, M4 Tap</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MFF101/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1&#34; Stackable Lens Tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stackable Lens Mount for 1&#34; optic-usable depth &#189;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stackable Lens Mount For 1&#34;Optic-usable Depth 2&#34;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 600mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA600/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 75mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA075/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 150mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA150/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Carrier, Counterbored Hole 1&#34;x 1&#34;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RC1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Carrier, Perpendicular Dovetail</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RC3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>High Precision Translating Lens Mount for 1 inch</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LM1XY/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#189; &#34; (12mm) Dovetail Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DT12/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Clamps</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CL6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Black Rubberized Fabric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BK5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Ball Driver kit/ 6 tools</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BD-KIT/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP6M4M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lens Mount for 25.4mm optic</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LMR1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SM1 FC/APC Adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1FCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S120C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, 
			L=50 mm, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH50/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH20/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR50/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR75/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>USB Power and Energy Meter Interface</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR30/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR20/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>750 mm long Structural Rail (detection box)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25L750/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>350 mm long Structural Rail (detection box)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25L350/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Quick Corner Cube for 25 mm Rails</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25W3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Right-Angle Bracket for 25 mm Rails</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25A90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Black posterboard 20&#34; x 30&#34; (508 mm x 762 mm), 1/16&#34; (1.6 mm) Thick, 5 Sheets</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TB5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hinge for 25 mm Rail Enclosures</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>M4 Cap Screw Kit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HW-KIT1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>M6 Cap Screw Kit and Hardware kit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HW-KIT2/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Table Clamp, L-Shape, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CL5-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (&#216;0.8 - &#216;12 mm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1D12D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#216;1&#34; SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/&#216;1 mm Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DG10-1500-H1-MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Honeycomb Optical Table Top, Standa</td>
			<td>Standa</td>
			<td>1HB10-15-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Optical Table support, Standa</td>
			<td>Standa</td>
			<td>1TS05-12-06-AR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample nano-positionning</td>
			<td>Precision XYZ Nanopositioning</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>PI P527-3.CD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V 
			Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors,</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>PI E727-3.CD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature chamber</td>
			<td>Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dual Channel Microprocessor Temperature Controller</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_MTC_2000_DUO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Two Vibration Free Heater Modules</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_150_VF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PT100 Temperature Sensor</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_P100_TS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture and transfection</td>
			<td>Cos7 cells</td>
			<td>ATCC&#174;</td>
			<td>CRL-1651&#8482;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>8- well Lab-Tek chambers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155411PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PolyJet Transfection Reagent</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol content measurement</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>87786</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78420</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ROTI Nanoquant Working Solution</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K880</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>GloMax Discover Microplate Reader</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>svFCS measurements</td>
			<td>HBSS buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hepes buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Cholesterol oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8868</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83697-1G</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot variation fluorescence correlation spectroscopy for analysis of molecular diffusion at the plasma membrane of living cells

Plazma zarı organizasyonu ile ilişkili olanlar da dahil olmak üzere canlı hücrelerdeki dinamik biyolojik süreçler, sırasıyla nanometrelerden mikrometrelere ve mikrosaniyelerden dakikalara kadar değişen çeşitli mekansal ve zamansal ölçeklerde meydana gelir. Bu kadar geniş bir biyolojik süreç yelpazesi, geleneksel mikroskopi yaklaşımlarına meydan okuyor. Burada, özelleştirilen klasik bir floresan mikroskobu kullanarak nokta varyasyonu Floresan Korelasyon Spektroskopisi (svFCS) ölçümlerini uygulama prosedürünü detaylandırıyoruz. Protokol, svFCS kurulumunun özel bir performans kontrolünü ve fizyolojik koşullar altında canlı hücrelerin plazma zarı üzerinde svFCS tarafından moleküler difüzyon ölçümleri için kılavuzları içerir. Ek olarak, kolesterol oksidaz tedavisi ile plazma membran sal nanodomainlerini bozmak için bir prosedür sunuyoruz ve plazma zarının lateral organizasyonundaki bu değişikliklerin svFCS analizi ile nasıl ortaya çıkarılabileceğini gösteriyoruz. Sonuç olarak, bu floresan bazlı yöntem, plazma zarının lateral organizasyonu hakkında uygun mekansal ve zamansal çözünürlükle benzeri görülmemiş detaylar sağlayabilir.

Cos-7 hücrelerinde eksprese edilen Thy1-GFP için bir DL ürettik (Şekil 4, siyah kareler). Difüzyon yasası pozitif bir t0 değerine (19.47 ms ± 2 ms) sahiptir, bu da Thy1-GFP'nin plazma zarının nanodomain yapılarında sınırlı olduğunu gösterir. Thy1-GFP'yi eksprese eden hücrelerin kolesterol oksidaz tedavisi, DL t0 değerinin 7.36 ± 1.34 ms'ye kaymasıyla sonuçlanmıştır (Şekil 4, gri kareler). Bu gözlem, Thy1-GFP hapsinin doğasının kolesterol içeriğine bağlı olduğunu ve lipit sal nanodomainleri ile ilişkili olduğunu doğrulamaktadır. Bu iki difüzyon yasasının, yukarıda açıklanan istatistiksel teste göre (bkz. adım 9.1.3) t0 ve Deff değerleri açısından farklı olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, tedavi edilmemiş Cos-7 hücrelerinde toplam hücresel kolesterol konsantrasyonunu, COaz ile tedavi edilen hücrelere karşı değerlendirdik. COaz tedavisi üzerine total kolesterol içeriğinde küçük ama anlamlı bir azalma gözlenir (Şekil 5). Bu enzim sadece plazma zarının dış broşüründe erişilebilen kolesterol havuzuna etki ettiğinden, kolesterolde gözlenen azalmanın sadece plazma zarı ile ilişkili olduğunu ve lipit sal nanodomainlerinin dengesizleşmesine neden olduğunu varsayıyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg"> Şekil 1: Farklı membran organizasyonu formları için nokta varyasyonu FCS tarafından oluşturulan simüle edilmiş floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) difüzyon yasaları. (Üst paneller) Membran organizasyonunun şematik gösterimi - (A) serbest difüzyon, (B) örgü bariyerleri ve (C) tuzak / etki alanı hapsedilmeleri - tek bir molekül için çizilen yörünge (kırmızı). Mavi daireler, zarın kesişimini ve bel ω lazer ışınını gösterir. (Alt paneller) FCS difüzyon yasaları, difüzyon zamanının t d'yi ω2 karesinin bir fonksiyonu olarak çizerek temsil edilir. Difüzyon yasası projeksiyonu (yeşil kesikli çizgi), serbest difüzyon durumunda (A) orijinde (t 0 = 0) zaman eksenini keser; (B) örgü bariyerleri olduğunda negatif eksende (t 0 < 0) veya tuzaklar ve alanlar (lipit salları) olduğunda (C) pozitif eksende (t0 > 0) D, Brownian hareketi için yanal difüzyon katsayısıdır; Deff, etkili difüzyon katsayısı; Dmikro, ağ tuzaklarının içindeki mikroskobik difüzyon katsayısı; Diçinde, etki alanları içindeki difüzyon katsayısı; Ddışarı, etki alanları dışındaki difüzyon katsayısı; L, kare bir alanın kenarının boyutu; ve rD, dairesel bir alanın yarıçapı. Bu rakam He ve Marguet6'dan değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg"> Şekil 2: svFCS donanım denetiminin şematik görünümü. Bilgisayar tüm cihazları farklı iletişim protokolleri aracılığıyla kontrol eder: seri (mikroskop, harici deklanşör), USB (XYZ piezoelektrik aşama, korelatör) ve PCI (edinme kartı). DAQ: veri toplama kartı, APD: çığ fotodiyot, SPCM: tek foton sayma modülü, DO: dijital çıkış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg"> Şekil 3: svFCS kurulumunun uyarma ve emisyon optik yollarının şematik görünümü. svFCS kurulumu dört modül içerir: (1) fiberli bir 488 nm lazerin çıkışı harmanlanır, (2) yarım dalga plakası ve polarize edici ışın ayırıcının bir kombinasyonu optik gücü ayarlar, (3) tüp lenssiz motorlu mikroskoptan geçtikten sonra numuneye odaklanan lazer ışını ve (4) floresan, tek bir foton sayma modülüne bağlı bir çığ fotodiyotuna konfokal benzeri bir algılama yolu aracılığıyla tespit edilir, bu da bir donanım korelatörüne sinyal gönderir. Sadelik, sisteme hassasiyetini, sağlamlığını ve kullanım kolaylığını verir ( Ek materyalde yaygın olarak yorumlanmıştır). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg"> Şekil 4: Cos-7'de ifade edilen Thy1-GFP'nin difüzyon analizinden elde edilen svFCS difüzyon yasaları. Cos-7 hücrelerinin tedavi edilmeden (NT, siyah kareler) ve kolesterol oksidaz tedavisinden sonra (COaz, gri daireler) svFCS difüzyon yasaları. Grafikteki ek, sunulan iki svFCS difüzyon yasası arasındaki anlamlı farkın istatistiksel testini temsil etmektedir (Mailfert ve ark.28'e göre). Test değeri (T), her iki difüzyon yasası farklı olduğunda 3.8 olarak ayarlanan eşiğin üzerinde olmalıdır. Ne kadar yüksek olursa, difüzyon yasaları arasındaki fark da o kadar büyük olur. T değeri renk kodludur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg"> Şekil 5: Cos-7 hücrelerinde toplam kolesterol içeriğinin karşılaştırılması. Cos-7 hücreleri ya tedavi edilmedi (NT) ya da 1 saat boyunca 1 U / mL kolesterol oksidaz (COaz) ile tedavi edildi. Veriler, üçlü olarak yapılan bir denemenin bir örneğini temsil eder. İstatistiksel farkı değerlendirmek için iki kuyruklu, eşleşmemiş bir t-testi kullanıldı (α=0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Malzeme tablosu: svFCS kurulumu için gereken optik elemanların listesi.
Ek materyal: Bu belgede, svFCS kurulumunun sıfırdan oluşturulması açıklanmaktadır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells at JoVE.com

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Bu makale, canlı hücrelerin plazma zarındaki moleküler difüzyonu ölçmek için nokta varyasyonu Floresan Korelasyon Spektroskopisi (svFCS) mikroskobunun nasıl oluşturulacağına dair bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.

Canlı Hücrelerin Plazma Membranında Moleküler Difüzyonun Analizi için Spot Varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

spot-variation-fluorescence-correlation-spectroscopy-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

2.6K Görüntüleme.  Aix Marseille Univ. Bu makale, canlı hücrelerin plazma zarındaki moleküler difüzyonu ölçmek için nokta varyasyonu Floresan Korelasyon Spektroskopisi (svFCS) mikroskobunun nasıl oluşturulacağına dair bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.

Video: Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

PI(4,5)P2 regulates various cellular functions, but its nanoscale organization in the cell plasma membrane is poorly understood. By labeling PI(4,5)P2 with a dual-color fluorescent probe fused to the Pleckstrin Homology domain, we describe a novel approach to study the PI(4,5)P2 spatial distribution in the plasma membrane at the nanometer scale.

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Biyokimya

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize proteins, DNAs, RNAs, and their complexes can however not be predicted. Employing a broad variety of conditions is a way to increase the yield of quality diffraction crystals. Two fully automated systems have been developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, England, MRC-LMB) that facilitate crystallization screening against 1,920 initial conditions by vapor diffusion in nanoliter droplets. Semi-automated protocols have also been developed to optimize conditions by changing the concentrations of reagents, the pH, or by introducing additives that potentially enhance properties of the resulting crystals. All the corresponding protocols will be described in detail and briefly discussed. Taken together, they enable convenient and highly efficient macromolecular crystallization in a multi-user facility, while giving the users control over key parameters of their experiments.

Automated systems and protocols for the routine preparation of a large number of screens and nanoliter crystallization droplets for vapor diffusion experiments are described and discussed.

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...