SB, SM 및 DM은 CNRS, Inserm 및 Aix-Marseille University의 기관 자금 지원과 프랑스 국립 연구 기관 (ANR-17-CE15-0032-01 및 ANR-18-CE15-0021-02)과 프랑스 "Investissement d'Avenir"(ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM)의 프로그램 보조금으로 지원되었습니다. KW는 생명 공학 및 나노 기술 분야에서 학제 간 환경 박사 과정 인 "BioTechNan"을 인정합니다. EB는 프로젝트 번호 2016/21/D/NZ1/00285에 따라 폴란드 국립 과학 센터 (NCN)와 프랑스 정부 및 폴란드 프랑스 대사관의 재정 지원을 인정합니다. MŁ는 폴란드 개발부 (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19)와 국립 연구 개발 센터 (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17)의 재정 지원을 인정합니다. TT는 프로젝트 번호 2016/21/B/NZ3/00343에 따라 폴란드 국립 과학 센터 (NCN)와 브로츠와프 생명 공학 센터 (KNOW)의 재정 지원을 인정합니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에서는 FCS 확산법 분석 덕분에 살아있는 세포에서 원형질막 조직의 역학을 해독하는 강력한 실험 접근법 인 표준 형광 현미경에서 svFCS 모듈의 구현을 설명했습니다. 개념적으로, svFCS는 간단한 원리에 기초한다: 조명 영역(23)의 크기를 변화시키면서 시간 영역에서의 형광의 상관관계 측정. 이 전략은 현미경 측정에서 나노스코픽 정보를 추론하는 데 중요한 역할을 했으며, 이는 정상 상태(25) 및 생리적 과정 30,31,32,33에서 원형질막 조직에 기여하는 주요 물리화학적 요소를 해독하는 데 도움이 된다. 전체적으로, 이러한 svFCS 분석은 다양한 세포 유형에서 지질 의존성 나노 도메인의 존재와 다른 신호 전달 사건을 튜닝하는 데 직접적인 영향을 미친다는 것을 명확하게 보여줍니다.
이 프레임 워크 내에는 광자 예산을 최적화하고 광학 수차를 최소화하기 위해 svFCS 설정을 구축하는 동안 고려해야 할 몇 가지 광학적 측면이 있습니다. 따라서 svFCS 측정을 수행할 때 튜브 렌즈를 제거할 수 있는 현미경을 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 단일 아이리스는 svFCS 설정에서 중요한 역할을 합니다: 목표물의 뒤쪽 조리개에서 빔 크기를 변경하여 효과적인 허리 크기(즉, 유효 여기 볼륨)를 직접 변경합니다. 빔 직경은 가장 작은 허리 크기(34)를 얻기 위해 객관적인 뒷동공에 맞아야 한다. 허리 크기를 조정하는 데 도움이되는이 옵션은 광자 예산의 최적화를 보장하고 구현하기 쉽습니다. 마지막으로, 최소 수의 광학 부품이 광 경로를 따라 사용됩니다. 시스템이 덜 복잡할수록 손실되는 광자가 줄어 듭니다. 이러한 모든 옵션은 svFCS 실험의 견고성을 크게 향상시킵니다.
프로토콜 자체와 관련하여 몇 가지 중요한 단계를 고려해야합니다. 가장 중요한 것은 성공적인 svFCS 측정에 중요한 광 경로의 적절한 정렬입니다 (프로토콜, 섹션 2). 이는 2 nM Rh6G 용액으로부터의 형광 신호를 분석함으로써 쉽게 확인할 수 있으며, 이는 300 μW 레이저 조명 하에서 ∼200 kHz이어야 한다. 모든 홍채를 열어야 하며 ACF는 중요한 진폭(일반적으로 G0~1.5–2.0)을 가져야 합니다. 또 다른 중요한 점은 세포와 svFCS 분석을위한 준비에 관한 것입니다 (프로토콜, 섹션 4-8). 그들의 밀도는 관찰 될 분리 된 세포가 분석에 사용할 수 있도록 적응되어야합니다. 비부착성 세포는 폴리-L-라이신 용액을 사용하여 챔버형 커버글라스 상에 고정화되어야 한다. 세포 표지로부터의 형광 신호는 너무 강하지 않아야하며, 또는 맞추기 어려운 매우 평평한 ACF를 초래할 것이며, 적합 매개 변수는 중요한 오류로 부담됩니다. 또한, 세포의 비균질한 표지 및 형광 응집체는 svFCS 측정을 해석하기가 매우 어렵게 만든다. 마지막으로, 콜레스테롤 산화 효소 처리는 세포 생존율에 영향을 미치며, svFCS 분석은 치료 후 한 시간을 초과해서는 안됩니다. 또한 지지체에 부착되지 않기 때문에 상부 원형질막으로부터의 형광 변동을 기록하는 것이 더 좋으며, 지지체와의 물리적 상호 작용으로 인해 분자의 확산이 방해받을 위험이 없습니다.
svFCS 기술은 검출량을 조정하기 위한 양식의 다양성 때문에 다양한 접근법에서 사용하기 위한 충분한 진보가 있었고, 살아있는 세포에서 다양한 생물학적 과정을 연구할 수 있게 되었다. 여기 부피의 크기를 조정하는 대안은 가변 빔 확장기(35)를 사용하는 것이다. 또한, z 방향(36)을 따라 원형질막의 인터셉트로부터 형광 신호를 기록함으로써 조명 영역의 크기를 간단하게 변조할 수도 있다. 이것은 확산 법칙37,38을 도출하기 위해 이론적 틀이 개발 된 표준 공초점 현미경에서 수행 할 수 있습니다.
svFCS 방법이 원형질막의 불균질한 측면 조직의 특성화에 필요한 시공간 분해능을 제공하지만, 기하학적 감금 모드는 상호 배타적이지 않습니다. 한 방향 또는 다른 방향에서 t0의 편차는 배타적으로 지배적인 감금 모드(25)를 드러낸다. 더욱이, 본 svFCS 방법의 또 다른 중요한 한계는 고전적인 광학 회절 한계 (∼200 nm)로부터 기인한다. 이것은 의심할 여지없이 세포 원형질막 내에 분자를 가두는 도메인보다 더 크다. 따라서, 감금의 분석은 확산 법칙으로부터 외삽된 t0 값으로부터 추론된다.
이러한 단점은 대체 방법을 구현함으로써 극복되었습니다. 초기에, 나노애퍼처로 뚫린 금속 필름을 사용하는 것은 매우 작은 막 영역(즉, 75nm와 250nm 사이에서 변하는 반경의 단일 나노메트릭 개구들의 광학 회절 한계 이하)39를 조명할 수 있는 가능성을 제공하였다. 단리된 도메인 조직에 대한 이론적 확산 법칙으로부터 예측된 전이 정권이 따라서 보고되었고, 나노메트릭 멤브레인 이질성의 특징적인 크기의 정제와 지질 의존성 나노도메인39에 의해 점유된 표면적의 정량적 추정을 허용하였다. 대안적으로, 나노메트릭 조명은 또한 근거리 스캐닝 광학 현미경(40) 또는 평면 광학 나노안테나(41)를 사용하여 개발되었다. 보다 최근에, 자극 방출 고갈(STED)과 FCS의 결합은 매우 높은 공간 분해능으로 확산 법칙을 문서화하는 강력하고 민감한 도구를 제공하였다. 이 STED-FCS는 단기간 내에 발생하는 나노스케일의 분자 확산 특성에 대한 액세스를 허용하여, 원형질막(42,43)에서 지질 프로브의 동적 조직에 대한 연구를 가능하게 한다. 그러나, STED 공정에서 형광의 불완전한 억제는 FCS에서의 자기상관곡선의 분석에 도전한다.
이러한 어려움을 극복하기 위해 새로운 피팅 모델이 개발되어 확산 시간 및 평균 분자 수 측정(44)의 정확도가 향상되었다. 마지막으로, 원형질막에서의 느린 분자 확산을 위해, svFCS 원리는 이미지 상관 분광법(45)에 의해 기록된 데이터에 적용될 수 있다. 최근에, 원자력 현미경 (AFM)과 이미징 총 내부 반사-FCS (ITIR-FCS)의 결합이 나노 도메인(46)의 고밀도로 인해 원형질막, 특히 퍼콜레이션 임계 막 구성 근처에서 분자 확산을 방해하는 메커니즘의 성질의 개선에 기여한다는 것이 입증되었다.
결론적으로, svFCS에 의한 확산 법칙을 확립하는 것은 동적 집단 지질 및 막 단백질의 연관성에 의해 생성 된 국소 이질성을 추론하기위한 실험 증거를 제공했다. Wohland와 동료(46)가 언급 한 바와 같이, "FCS 확산 법 분석은 동적 정보로부터 해결 한계 이하의 구조적 및 조직적 특징을 추론하는 데 유용한 도구로 남아 있습니다." 그럼에도 불구하고, 우리는 원형질막에서 발생하는 분자 사건의 역학에 대한 더 나은 이해를 허용해야하는 확산 법칙의 해석을 개선하기위한 새로운 모델을 개발해야합니다.

원형질막 조직의 복잡성 세포막 조직에 대한 현재의 이해는 몇 가지 측면1을 고려해야합니다. 첫째, 복합 지질 조성은 세포 유형뿐만 아니라 단일 세포 (막 소기관 / 원형질막) 내에서도 다양합니다. 게다가, 관련 또는 내재적 막 단백질은 대부분 동적 다량체 복합체로 조직되며, 막의 외부로 연장되는 큰 도메인이 막횡단 도메인 단독보다 훨씬 큰 면적을 차지한다. 더욱이, 막-관련 단백질은 단백질 기능을 조절하는데 역할을 하는 특이적 지질-결합 또는 지질-상호작용 능력을 나타낸다. 이들은 지질의 국소 조성 및 접근성에 직접적으로 의존한다2.
마지막으로, 막 단백질의 본질적인 비대칭 구조와 지질의 분포로 인해 두 막 전단지 사이에서 상당한 수준의 비대칭이 관찰됩니다. 실제로, 합성과 가수분해 사이의 지질 대사 균형은 전단지 사이의 지질 플립 플롭과 결합하여 그러한 비대칭 분포를 생성합니다. 이중층을 가로지르는 임의의 수송은 멤브레인의 소수성 내부를 통해 극성 헤드 그룹을 이동시키는 데 필요한 자유 에너지에 의해 제약되기 때문에, 그것은 일반적으로 선택적 수송기에 의해 보조된다. 각 세포 유형에 대해 비대칭은 단단히 유지되는 경향이 있습니다. 전체적으로, 이들 인자는 원형질막(3,4)의 측방향 불균질성 또는 구획화에 기여한다.
우리는 이중층 내부 및 전반에 걸친 고유 한 분자 확산을 고려하여 원형질막의 이러한 표현을 풍부하게하며, 이는 열 번째에서 수백 나노 미터 및 마이크로 초에서 초까지의 규모로 동적 측면 이질성에 기여합니다. 예를 들어, 지질 의존성 막 나노 도메인 - 콜레스테롤로 정의 된 소위 지질 뗏목과 스핑고지질이 풍부한 신호 전달 플랫폼 -은 원형질막 5,6의 구획화에 기여합니다. 그러나, 막 조직에 대한 현재의 견해는 지질 뗏목에만 국한되지 않는다. 막 나노도메인은 조성, 기원 및 기능에서 더 복잡하고 이질적이다. 여전히, 원형질막에서의 그들의 존재는 긴밀하게 조정되어야 하고, 단백질과 지질 사이의 동적 상호작용은 막 나노 도메인 1,3,7,8의 공간 분포 및 화학적 변형에 중요한 것으로 보인다.
svFCS 원리와 원형질막의 조직을 조사하기 위한 그것의 응용 주로 생물물리학적 기술을 통해 막 도메인의 분석에서 많은 진전이 이루어졌지만, 원형질막의 국소 조직을 지시하는 결정인자는 적절한 공간적, 시간적 분해능으로 정제될 필요가 있다. 개별 분자 추적에 기반한 결정인자는 우수한 공간 정밀도를 제공하고다양한 동작 모드의 특성화를 허용하지만 9,10,11,12의 다양한 모드의 특성화를 허용하지만 고전적인 낮은 카메라 프레임 속도로 제한된 시간 해상도를 가지며 상당한 수의 궤적을 기록하기 위해 더 많은 실험적 노력이 필요합니다. 대안적으로, 막 성분의 확산 계수는 광표백 후 형광 회수 (FRAP)13 또는 형광 상관 분광법 (FCS)14에 의해 평가될 수 있다. 후자는 주로 높은 감도와 선택성, 현미경 탐지량, 낮은 침습성 및 넓은 동적 범위15로 인해 더 많은 주목을 받았습니다.
FCS의 개념적 기초는 약 50 년 전16,17 년 전에 Magde와 동료들에 의해 소개되었습니다. 이는 높은 시간적 분해능(μs에서 s까지)을 갖는 형광 방출의 변동을 기록하는 것에 기초한다18. 현대 버전에서, 살아있는 세포에서의 측정은 관심 영역 내에 위치된 작은 공초점 여기 부피 (~0.3 펨톨리터)에 의해 수행된다 (예를 들어, 원형질막에서); 관찰 부피의 안팎으로 들어가는 형광 분자를 확산시킴으로써 생성된 형광 신호는 매우 높은 시간적 분해능(즉, 검출기 상의 각 광자의 도착 시간)으로 수집된다. 이어서, 신호는 자기상관 함수(ACF)를 생성하기 위해 계산되고, 이로부터 분자가 초점 부피 내에 머무르는 평균 시간td(확산 시간)가 추출되고, 입자의 평균 수와 함께, ACF의 진폭에 반비례하는 관찰 부피에 존재하는 (N)이 추출된다. 이 마지막 파라미터는 관찰 부피 내의 분자 농도에 대한 유용한 정보일 수 있다.
그 이후로, 바이오 포토닉스에서 빠르게 발전하는 계측 덕분에 점점 더 많은 FCS 양식이 구현되어 살아있는 시스템에서 발생하는 역동적 인 현상에 대한 설명이 가능해졌습니다. 그럼에도 불구하고, 분자 종은 확산 계수 값의 더 겹치는 분포를 경험할 것이며, 이는 일반적으로 분자가 시간19에서 비선형 관계로 확산되는 변칙적 확산 특성에 의해 반영되며,이 변칙적 인 하위 확산의 생물학적 의미를 식별하는 데 어려움이 있습니다. 과거에는 FRAP에 의한 분자 확산을 단지 하나의 영역이 아닌 다양한 크기의 영역으로부터 기록함으로써 이러한 어려움이 다소 극복되어 추가적인 공간 정보를 제공하였다. 이것은 예를 들어, 막 마이크로도메인20,21,22의 개념화를 가능하게 하였다.
FCS 측정(즉, 소위 스폿 변동 형광 상관 분광법(svFCS))에 대한 이 전략의 번역은 관찰의 초점 부피의 크기를 변화시킴으로써 확립되었고, 형광의 변동이 상이한 공간 스케일(23)에 기록될 수 있게 하였다. 따라서, svFCS 접근법은 연구된 분자의 분자 확산 모드 및 막 분할의 유형(단리된 대 인접 도메인(24))의 확인 및 결정을 허용하는 간접적인 공간 정보를 제공한다. 확산 시간td를 허리(ω) 값에 의해 정의된 다양한 공간 스케일의 함수로서 플로팅함으로써, 이 경우23,25의 검출 빔 반경 크기에 대응하나, 주어진 생리학적 조건에서 주어진 분자의 확산 법칙을 특성화할 수 있다. 따라서, svFCS는 시간 영역(26)에서 단일 입자 추적에 대한 완벽한 아날로그이다. 브라운 확산 제약 하에서, 확산 시간td와 허리 ω 사이의 엄격한 선형 관계를 기대해야 한다(그림 1)23,25. 이 계획으로부터의 확산 법칙의 편차의 기원은 세포 골격 메쉬 워크, 분자 우집, 나노 도메인에서의 동적 분할 또는 이들 및 기타 효과의 임의의 조합과 같은 비독점적 인 이유에 기인 할 수 있으며 (그림 1), 실험적으로 테스트 할 필요가 있습니다25.
여기에서는 처음부터 구축된 맞춤형 svFCS 광학 시스템을 매일 사용하는 데 필요한 모든 제어 체크포인트를 제공하며, 이는 실험적 접근 방식에 대한 이전 프로토콜 리뷰27,28을 보완합니다. 또한, 개념 증명으로서, 우리는 지질-래프트 나노도메인29에 국한된 것으로 알려진 원형질막 글리코실포스파티딜이노시톨-앵커드 단백질인 Thy1-GFP에 대한 svFCS 확산법(DL)의 확립을 위한 설정, 세포의 준비, 데이터 수집 및 분석의 교정에 관한 지침을 제공한다. 마지막으로, 우리는 콜레스테롤 옥시다제 처리에 의한 지질 - 뗏목 나노 도메인의 부분적 불안정화가 Thy1-GFP의 확산 특성에 어떻게 영향을 미치는지 보여줍니다. 또한 svFCS 설정을 처음부터 빌드하는 방법에 대한 자세한 설명은 보충 자료에 나와 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aligment tool</td>
			<td>Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SPW602</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM)</td>
			<td>Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>SPCM-AQRH-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BNC 50 &#937; plug to 50 &#937; plug lead 2 m</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>742-4315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 &#937; With connector, 1.22 m, RoHS2</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>885-8172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Tee 50&#937; RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 &#8594; 1GHz</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>546-4948</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E &#8211; French Extension Lead, 230 V</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>768-5500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>452-8394</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>792-4079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filtering</td>
			<td>535/70 ET Bandpass, AOI 0&#176; Chroma Diameter 25 mm</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F47-539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45&#176; Chroma 25.5 x 36 x 1 mm</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F43-088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0&#176; Chroma Diameter 25</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F37-496</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware correlator</td>
			<td>80 MHz Digital Correlator</td>
			<td>Correlator.com</td>
			<td>Flex02-12D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW</td>
			<td>Lasos</td>
			<td>BLD-XT 488100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety</td>
			<td>High-Performance Black Masking Tape, 1&#34; x 180&#39; (25 mm x 55 m) Roll</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T743-2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MC-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG3B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope 
			Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS 
			(D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>421767-9971-711</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adapter W0.8 / M27x0.75 H &#34;5&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1698-345</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Middle ring W0.8 - W0.8 H &#34;5&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1698-347</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical path</td>
			<td>D25.4mm Mirror, Protected Silver</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25 &#181;m mounted pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P25S I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPH10M-488 (HWP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RSP1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100B/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adjustable Prism Clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM3/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Beam block - active area 19 mm x 38 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LB1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ID25/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100CL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1&#34; Optic Holder, M4 Tap</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MFF101/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1&#34; Stackable Lens Tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stackable Lens Mount for 1&#34; optic-usable depth &#189;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stackable Lens Mount For 1&#34;Optic-usable Depth 2&#34;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 600mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA600/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 75mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA075/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 150mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA150/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Carrier, Counterbored Hole 1&#34;x 1&#34;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RC1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Carrier, Perpendicular Dovetail</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RC3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>High Precision Translating Lens Mount for 1 inch</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LM1XY/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#189; &#34; (12mm) Dovetail Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DT12/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Clamps</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CL6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Black Rubberized Fabric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BK5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Ball Driver kit/ 6 tools</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BD-KIT/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP6M4M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lens Mount for 25.4mm optic</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LMR1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SM1 FC/APC Adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1FCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S120C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, 
			L=50 mm, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH50/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH20/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR50/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR75/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>USB Power and Energy Meter Interface</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR30/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR20/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>750 mm long Structural Rail (detection box)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25L750/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>350 mm long Structural Rail (detection box)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25L350/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Quick Corner Cube for 25 mm Rails</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25W3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Right-Angle Bracket for 25 mm Rails</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25A90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Black posterboard 20&#34; x 30&#34; (508 mm x 762 mm), 1/16&#34; (1.6 mm) Thick, 5 Sheets</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TB5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hinge for 25 mm Rail Enclosures</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>M4 Cap Screw Kit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HW-KIT1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>M6 Cap Screw Kit and Hardware kit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HW-KIT2/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Table Clamp, L-Shape, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CL5-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (&#216;0.8 - &#216;12 mm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1D12D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#216;1&#34; SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/&#216;1 mm Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DG10-1500-H1-MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Honeycomb Optical Table Top, Standa</td>
			<td>Standa</td>
			<td>1HB10-15-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Optical Table support, Standa</td>
			<td>Standa</td>
			<td>1TS05-12-06-AR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample nano-positionning</td>
			<td>Precision XYZ Nanopositioning</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>PI P527-3.CD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V 
			Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors,</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>PI E727-3.CD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature chamber</td>
			<td>Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dual Channel Microprocessor Temperature Controller</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_MTC_2000_DUO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Two Vibration Free Heater Modules</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_150_VF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PT100 Temperature Sensor</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_P100_TS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture and transfection</td>
			<td>Cos7 cells</td>
			<td>ATCC&#174;</td>
			<td>CRL-1651&#8482;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>8- well Lab-Tek chambers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155411PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PolyJet Transfection Reagent</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol content measurement</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>87786</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78420</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ROTI Nanoquant Working Solution</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K880</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>GloMax Discover Microplate Reader</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>svFCS measurements</td>
			<td>HBSS buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hepes buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Cholesterol oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8868</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83697-1G</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot variation fluorescence correlation spectroscopy for analysis of molecular diffusion at the plasma membrane of living cells

원형질막 조직과 관련된 것을 포함하여 살아있는 세포의 동적 생물학적 과정은 각각 나노미터에서 마이크로미터 및 마이크로초에서 분에 이르는 다양한 공간적 및 시간적 스케일에서 발생한다. 이러한 광범위한 생물학적 과정은 기존의 현미경 검사 접근법에 도전합니다. 여기에서는 맞춤형 클래식 형광 현미경을 사용하여 스팟 변동 형광 상관 분광법 (svFCS) 측정을 구현하는 절차를 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에는 svFCS 설정의 특정 성능 검사 및 생리적 조건 하에서 살아있는 세포의 원형질막에서 svFCS에 의한 분자 확산 측정에 대한 지침이 포함됩니다. 또한, 우리는 콜레스테롤 산화 효소 처리에 의해 원형질막 뗏목 나노 도메인을 파괴하는 절차를 제공하고 svFCS 분석에 의해 원형질막의 측면 조직의 이러한 변화가 어떻게 밝혀 질 수 있는지 보여줍니다. 결론적으로, 이러한 형광 기반 방법은 적절한 공간 및 시간적 분해능을 갖는 원형질막의 측방향 조직에 대한 전례 없는 세부사항을 제공할 수 있다.

Cos-7 세포에서 발현된 Thy1-GFP에 대한 DL을 생성하였다(도 4, 검정 사각형). 확산 법칙은 양의 t0 값 (19.47 ms ± 2 ms)을 가지며, 이는 Thy1-GFP가 원형질막의 나노 도메인 구조에 국한되어 있음을 나타냅니다. Thy1-GFP를 발현하는 세포의 콜레스테롤 옥시다제 처리는 DL t0 값이 1.34 ms ± 7.36으로 이동되는 결과를 가져왔다 (도 4, 회색 사각형). 이 관찰은 Thy1-GFP 감금의 본질이 콜레스테롤 함량에 의존하고 지질 뗏목 나노 도메인과 관련이 있음을 확인합니다. 이들 두 확산 법칙은 t0 및 Deff 값의 관점에서 위에서 설명된 통계적 검정(단계 9.1.3 참조)에 따라 상이함을 나타내었다. 또한, 우리는 처리되지 않은 Cos-7 세포에서 COase로 처리 된 세포와 비교하여 총 세포 콜레스테롤의 농도를 평가했습니다. COase 처리 시 총 콜레스테롤 함량의 작지만 유의한 감소가 관찰됩니다(그림 5). 이 효소는 원형질막의 외부 전단지에서 접근 할 수있는 콜레스테롤 풀에서만 작용하기 때문에 콜레스테롤의 관찰 된 감소는 원형질막과 관련이 있으며 지질 뗏목 나노 도메인의 불안정화를 초래한다고 가정합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg"> 그림 1: 다양한 형태의 막 조직에 대해 스팟 변동 FCS에 의해 확립된 시뮬레이션된 형광 상관 분광법(FCS) 확산 법칙. (상부 패널) 막 조직의 개략적 표현 - (A) 자유 확산, (B) 메쉬 워크 장벽 및 (C) 트랩 / 도메인 감금 - 단일 분자 (빨간색)에 대해 그려진 궤적. 파란색 원은 허리 ω의 멤브레인과 레이저 빔의 교차점을 나타냅니다. (하부 패널) FCS 확산 법칙은 확산 시간 td를 제곱 반지름 ω2의 함수로 플로팅함으로써 표현된다. 확산 법칙 돌출부(녹색 점선)는 자유 확산의 경우에 (A) 원점(t0=0)에서 시간 축을 인터셉트하고; (B) 메쉬 워크 장벽이있을 때 음축 (t0 < 0)에서, 또는 트랩과 도메인 (지질 뗏목)이있을 때 양축 (t0 > 0)에서 (C). D는 브라운 운동에 대한 측면 확산 계수이고; Deff, 유효 확산 계수; D마이크로, 메쉬워크 트랩 내부의 미세한 확산 계수; D에서, 도메인 내부의 확산 계수; Dout, 외부 도메인 확산 계수; L, 정사각형 도메인의 측면의 크기; 및 rD, 원형 도메인의 반지름. 이 그림은 그분과 마르게트6에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg"> 그림 2: svFCS 하드웨어 제어의 개략도 컴퓨터는 직렬(현미경, 외부 셔터), USB(XYZ 압전 스테이지, 상관기) 및 PCI(수집 보드)와 같은 다양한 통신 프로토콜을 통해 모든 장치를 제어합니다. DAQ : 데이터 수집 보드, APD : 눈사태 광 다이오드, SPCM : 단일 광자 계수 모듈, DO : 디지털 출력. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg"> 그림 3: svFCS 설정의 여기 및 방출 광 경로의 개략도. svFCS 셋업은 네 개의 모듈을 포함한다: (1) 광섬유 488nm 레이저의 출력이 시준되고, (2) 반파 플레이트와 편광 빔 스플리터의 조합이 광전력을 설정하고, (3) 튜브-렌즈 프리 전동 현미경을 통해 진행한 후 샘플에 초점을 맞춘 레이저 빔, 및 (4) 단일 광자 계수 모듈에 결합된 애벌런치 광 다이오드 상으로의 공초점 형상 검출 경로를 통해 형광이 검출되고, 하드웨어 상관기에 신호를 전달합니다. 단순성은 시스템에 감도, 견고성 및 사용 편의성을 제공합니다 ( 보충 자료에 널리 언급되어 있음). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg"> 도 4: Cos-7에서 발현된 Thy1-GFP의 확산 분석으로부터 생성된 svFCS 확산 법칙. svFCS 처리하지 않고 Cos-7 세포의 확산 법칙 (NT, 검은 사각형) 및 콜레스테롤 산화 효소 처리 후 (COase, 회색 원). 그래프의 삽입물은 제시된 두 개의 svFCS 확산 법칙 사이의 유의한 차이에 대한 통계적 테스트를 나타낸다(Mailfert et al.28에 따름). 테스트 값(T)은 두 확산 법칙이 다를 때 3.8로 설정된 임계값을 초과해야 합니다. 높을수록 확산 법칙의 차이가 커집니다. T의 값은 색상으로 구분됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg"> 그림 5: Cos-7 세포에서 총 콜레스테롤 함량 비교. Cos-7 세포는 1시간 동안 비처리(NT) 또는 1U/mL의 콜레스테롤 산화효소(COase)로 처리되었다. 데이터는 삼중으로 한 실험의 예를 나타낸다. 두 꼬리, 짝을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 통계적 차이를 평가하였다(α=0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
물자의 표: svFCS 설정에 필요한 광학 요소 목록입니다.
보충 자료: 이 문서에서는 처음부터 svFCS 설정을 빌드하는 방법에 대해 설명합니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

이 기사는 살아있는 세포의 원형질막에서 분자 확산을 측정하기 위해 스팟 변이 형광 상관 분광법 (svFCS) 현미경을 구축하는 방법에 대한 프로토콜을 제시하는 것을 목표로합니다.

살아있는 세포의 원형질막에서의 분자 확산 분석을위한 스팟 변이 형광 상관 분광법

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

spot-variation-fluorescence-correlation-spectroscopy-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

2.7K 조회수.  Aix Marseille Univ. 이 기사는 살아있는 세포의 원형질막에서 분자 확산을 측정하기 위해 스팟 변이 형광 상관 분광법 (svFCS) 현미경을 구축하는 방법에 대한 프로토콜을 제시하는 것을 목표로합니다.

비디오: Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize proteins, DNAs, RNAs, and their complexes can however not be predicted. Employing a broad variety of conditions is a way to increase the yield of quality diffraction crystals. Two fully automated systems have been developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, England, MRC-LMB) that facilitate crystallization screening against 1,920 initial conditions by vapor diffusion in nanoliter droplets. Semi-automated protocols have also been developed to optimize conditions by changing the concentrations of reagents, the pH, or by introducing additives that potentially enhance properties of the resulting crystals. All the corresponding protocols will be described in detail and briefly discussed. Taken together, they enable convenient and highly efficient macromolecular crystallization in a multi-user facility, while giving the users control over key parameters of their experiments.

Automated systems and protocols for the routine preparation of a large number of screens and nanoliter crystallization droplets for vapor diffusion experiments are described and discussed.

분자 생물학의 MRC 실험실에서 고분자 결정에 대 한 프로토콜을 자동

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...