SB, SM e DM sono stati sostenuti da finanziamenti istituzionali del CNRS, dell'Inserm e dell'Università di Aix-Marseille e da sovvenzioni di programma dell'Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR-17-CE15-0032-01 e ANR-18-CE15-0021-02) e dell'"Investissement d'Avenir" francese (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). KW riconosce "BioTechNan", un programma di studi di dottorato ambientale interdisciplinare KNOW nel campo delle biotecnologie e delle nanotecnologie. EB riconosce il sostegno finanziario del National Science Centre of Poland (NCN) nell'ambito del progetto n. 2016/21/D/NZ1/00285, nonché del governo francese e dell'Ambasciata di Francia in Polonia. MŁ riconosce il sostegno finanziario del Ministero dello Sviluppo polacco (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) e del Centro nazionale per la ricerca e lo sviluppo (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). TT riconosce il sostegno finanziario del National Science Center of Poland (NCN) nell'ambito del progetto n. 2016/21/B/NZ3/00343 e del Wroclaw Biotechnology Center (KNOW).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui abbiamo descritto l'implementazione del modulo svFCS su un microscopio fluorescente standard, un potente approccio sperimentale per decifrare la dinamica dell'organizzazione della membrana plasmatica nelle cellule viventi grazie all'analisi della legge di diffusione FCS. Concettualmente, lo svFCS si basa su un principio semplice: misure di correlazione della fluorescenza nel dominio del tempo variando le dimensioni dell'area di illuminazione23. Questa strategia è stata determinante nel dedurre informazioni nanoscopiche da misurazioni microscopiche, che aiutano a decifrare i principali elementi fisico-chimici che contribuiscono all'organizzazione della membrana plasmatica in stato stazionario25 e processi fisiologici 30,31,32,33. Complessivamente, queste analisi svFCS dimostrano inequivocabilmente l'esistenza di nanodomini lipidi-dipendenti in vari tipi di cellule e la loro implicazione diretta nella sintonizzazione di diversi eventi di segnalazione.
All'interno di questo quadro, ci sono alcuni aspetti ottici che devono essere considerati durante la costruzione della configurazione svFCS per ottimizzare il budget dei fotoni e ridurre al minimo le aberrazioni ottiche. Pertanto, si consiglia di utilizzare un microscopio da cui è possibile rimuovere la lente del tubo quando viene eseguita la misurazione svFCS. Inoltre, un singolo diaframma gioca un ruolo chiave nella configurazione svFCS: cambia la dimensione del fascio all'apertura posteriore dell'obiettivo, variando così direttamente la dimensione effettiva della vita (cioè il volume di eccitazione effettivo). Il diametro del fascio dovrebbe adattarsi alla pupilla posteriore dell'obiettivo per ottenere la più piccola dimensione della vita34. Questa opzione, che aiuta a regolare il girovita, garantisce l'ottimizzazione del budget dei fotoni ed è facile da implementare. Infine, un numero minimo di parti ottiche viene utilizzato lungo il percorso della luce; meno complesso è il sistema, meno fotoni si perdono. Tutte queste opzioni migliorano significativamente la robustezza degli esperimenti svFCS.
Per quanto riguarda il protocollo stesso, devono essere considerati alcuni passaggi critici. Il più importante è un allineamento appropriato dei percorsi ottici che è cruciale per il successo delle misurazioni svFCS (protocollo, sezione 2). Questo è facile da controllare analizzando il segnale di fluorescenza da una soluzione Rh6G da 2 nM, che dovrebbe essere ~ 200 kHz sotto l'illuminazione laser di 300 μW. Tutte le iridi devono essere aperte e gli ACF devono avere un'ampiezza importante (in genere G0 ~ 1,5-2,0). Un altro punto critico riguarda le cellule e la loro preparazione per l'analisi svFCS (protocollo, sezioni 4-8). La loro densità deve essere adattata in modo che le cellule isolate da osservare siano disponibili per l'analisi. Le cellule non aderenti devono essere immobilizzate su un vetro di copertura camerato utilizzando una soluzione di poli-L-lisina. Il segnale di fluorescenza dall'etichettatura delle celle non dovrebbe essere troppo forte, o si tradurrà in ACF molto piatti che sono difficili da adattare e i parametri di adattamento sono gravati da un errore importante. Inoltre, l'etichettatura non omogenea e gli aggregati di fluorescenza nelle cellule rendono le misurazioni svFCS estremamente difficili da interpretare. Infine, il trattamento con colesterolo ossidasi influisce sulla vitalità cellulare e l'analisi svFCS non deve superare un'ora dopo il trattamento. È anche meglio registrare le fluttuazioni di fluorescenza dalla membrana plasmatica superiore in quanto non è attaccata al supporto e non vi è alcun rischio di diffusione ostacolata delle molecole a causa delle interazioni fisiche con il supporto.
Ci sono stati abbastanza progressi nella tecnica svFCS per il suo uso in diversi approcci a causa della diversità delle modalità per regolare il volume di rilevamento, rendendo possibile studiare vari processi biologici nelle cellule viventi. Un'alternativa alla regolazione della dimensione del volume di eccitazione consiste nell'utilizzare un espansore a fascio variabile35. È anche possibile modulare semplicemente la dimensione dell'area di illuminazione registrando il segnale fluorescente dall'intercettazione della membrana plasmatica lungo la direzione z36. Questo può essere fatto su un microscopio confocale standard per il quale è stato sviluppato un quadro teorico per derivare la legge di diffusione37,38.
Sebbene il metodo svFCS offra una risoluzione spazio-temporale, necessaria per la caratterizzazione dell'organizzazione laterale disomogenea della membrana plasmatica, le modalità geometriche di confinamento non si escludono a vicenda. Una deviazione di t0 in una direzione o nell'altra rivela esclusivamente un modo dominante di confinamento25. Inoltre, un'altra importante limitazione dell'attuale metodo svFCS deriva dal classico limite di diffrazione ottica (~200 nm). Questo è indiscutibilmente maggiore dei domini che confinano le molecole all'interno della membrana plasmatica cellulare. Pertanto, l'analisi del confinamento è dedotta dal valore t0 , estrapolato dalla legge di diffusione.
Questo inconveniente è stato superato implementando metodi alternativi. Inizialmente, l'uso di pellicole metalliche perforate con nanoaperture offriva la possibilità di illuminare un'area di membrana molto piccola (cioè al di sotto del limite di diffrazione ottica di singole aperture nanometriche di raggi variabili tra 75 e 250 nm)39. È stato così riportato il regime di transizione previsto dalla legge teorica di diffusione per l'organizzazione di domini isolati, che ha permesso un affinamento della dimensione caratteristica delle eterogeneità nanometriche della membrana e una stima quantitativa della superficie occupata dai nanodomini lipido-dipendenti39. In alternativa, l'illuminazione nanometrica è stata sviluppata anche utilizzando la microscopia ottica a scansione a campo vicino40 o nanoantenne ottiche planari41. Più recentemente, la combinazione di esaurimento delle emissioni stimolate (STED) e FCS ha fornito uno strumento potente e sensibile per documentare la legge di diffusione con una risoluzione spaziale molto elevata. Questo STED-FCS dà accesso alle caratteristiche di diffusione molecolare su scala nanometrica che si verificano in un breve periodo di tempo, consentendo lo studio dell'organizzazione dinamica delle sonde lipidiche sulla membranaplasmatica 42,43. Tuttavia, la soppressione incompleta della fluorescenza nel processo STED sfida l'analisi delle curve di auto-correlazione in FCS.
È stato sviluppato un nuovo modello di fitting per superare questa difficoltà, migliorando l'accuratezza dei tempi di diffusione e le misure medie del numero di molecole44. Infine, per una lenta diffusione molecolare sulla membrana plasmatica, il principio svFCS può essere applicato ai dati registrati mediante spettroscopia di correlazione delle immagini45. Recentemente, è stato dimostrato che la combinazione della microscopia a forza atomica (AFM) con l'imaging a riflessione interna totale-FCS (ITIR-FCS) contribuisce al perfezionamento della natura del meccanismo che ostacola la diffusione molecolare sulla membrana plasmatica, specialmente vicino alla configurazione della membrana di soglia di percolazione a causa di un'alta densità di nanodomini46.
In conclusione, stabilire la legge di diffusione mediante svFCS ha fornito le prove sperimentali per dedurre l'eterogeneità locale creata da lipidi collettivi dinamici e associazioni di proteine di membrana. Come affermato da Wohland e colleghi46, "l'analisi della legge di diffusione FCS rimane uno strumento prezioso per dedurre caratteristiche strutturali e organizzative al di sotto del limite di risoluzione dalle informazioni dinamiche". Tuttavia, abbiamo bisogno di sviluppare nuovi modelli per perfezionare l'interpretazione della legge di diffusione che dovrebbe consentire una migliore comprensione della dinamica degli eventi molecolari che si verificano sulla membrana plasmatica.

La complessità dell'organizzazione della membrana plasmatica L'attuale comprensione dell'organizzazione della membrana cellulare deve tenere conto di diversi aspetti1. In primo luogo, una composizione lipidica complessa varia non solo tra i tipi di cellule, ma anche all'interno di una singola cellula (organelli di membrana / membrana plasmatica). Inoltre, le proteine di membrana associate o intrinseche sono per lo più organizzate in complessi multimerici dinamici, con grandi domini che si estendono al di fuori della membrana, rappresentando un'area significativamente più ampia di quella dei soli domini transmembrana. Inoltre, le proteine associate alla membrana mostrano specifiche capacità di legame lipidico o di interazione lipidica che svolgono un ruolo nella regolazione della funzione proteica. Questi dipendono direttamente dalla composizione locale e dall'accessibilità dei lipidi2.
Infine, si osserva un livello significativo di asimmetria tra due foglietti di membrana a causa della struttura asimmetrica intrinseca delle proteine di membrana e della distribuzione dei lipidi. Infatti, un equilibrio metabolico lipidico tra sintesi e idrolisi, combinato con flip-flop lipidico tra i foglietti, genera tale distribuzione asimmetrica. Poiché qualsiasi trasporto attraverso il doppio strato è limitato dall'energia libera necessaria per spostare il gruppo di testa polare attraverso l'interno idrofobo delle membrane, di solito è assistito da trasportatori selettivi. Per ogni tipo di cellula, l'asimmetria tende ad essere mantenuta saldamente. Complessivamente, questi fattori contribuiscono alla disomogeneità laterale o alla compartimentazione della membranaplasmatica 3,4.
Arricchiamo questa rappresentazione della membrana plasmatica tenendo conto della diffusione molecolare intrinseca all'interno e attraverso il doppio strato, che contribuisce all'eterogeneità laterale dinamica su una scala da decimi a centinaia di nanometri e microsecondi a secondi. Ad esempio, i nanodomini di membrana lipidici-dipendenti – le cosiddette zattere lipidiche, definite come colesterolo, e le piattaforme di segnalazione ricche di sfingolipidi – contribuiscono alla compartimentazione della membranaplasmatica 5,6. Tuttavia, l'attuale visione dell'organizzazione della membrana non è limitata alle sole zattere lipidiche. I nanodomini di membrana sono più complessi ed eterogenei per composizione, origine e funzione. Tuttavia, la loro presenza sulla membrana plasmatica deve essere strettamente coordinata e le interazioni dinamiche tra proteine e lipidi sembrano essere importanti nella distribuzione spaziale e nella modifica chimica dei nanodomini di membrana 1,3,7,8.
Il principio svFCS e la sua applicazione per sondare l'organizzazione della membrana plasmatica Sebbene siano stati fatti molti progressi nell'analisi dei domini di membrana, principalmente attraverso tecniche biofisiche, i determinanti che dettano l'organizzazione locale della membrana plasmatica devono essere raffinati con un'appropriata risoluzione spaziale e temporale. I determinanti basati sul tracciamento di singole molecole forniscono un'eccellente precisione spaziale e consentono la caratterizzazione di diverse modalità di movimento 9,10,11,12, ma hanno una risoluzione temporale limitata con i classici frame rate bassi della telecamera e richiedono uno sforzo più sperimentale per registrare un numero significativo di traiettorie. In alternativa, il coefficiente di diffusione dei componenti della membrana può essere valutato mediante Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)13 o Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)14. Quest'ultimo ha ricevuto maggiore attenzione, principalmente a causa della sua elevata sensibilità e selettività, volume di rilevamento microscopico, bassa invasività e ampia gamma dinamica15.
La base concettuale di FCS è stata introdotta da Magde e colleghi circa 50 anni fa16,17. Si basa sulla registrazione della fluttuazione dell'emissione di fluorescenza con un'alta risoluzione temporale (da μs a s)18. Nella sua versione moderna, le misurazioni nelle cellule viventi sono eseguite da un piccolo volume di eccitazione confocale (~ 0,3 femtolitri) posizionato all'interno di una regione di interesse (ad esempio, alla membrana plasmatica); il segnale di fluorescenza generato dalla diffusione di molecole fluorescenti che entrano ed escono dal volume di osservazione viene raccolto con una risoluzione temporale molto elevata (cioè il tempo di arrivo di ciascun fotone sul rivelatore). Quindi, il segnale viene calcolato per generare la funzione di autocorrelazione (ACF), da cui viene estratto il tempo medio td (tempo di diffusione) per il quale una molecola rimane all'interno del volume focale, insieme al numero medio di particelle, (N), presenti nel volume di osservazione, che è inversamente proporzionale all'ampiezza dell'ACF. Quest'ultimo parametro potrebbe essere un'informazione utile sulla concentrazione della molecola all'interno del volume di osservazione.
Da allora, un numero crescente di modalità FCS è stato implementato grazie al rapido sviluppo della strumentazione in biofotonica, che consente la descrizione dei fenomeni dinamici che si verificano nei sistemi viventi. Tuttavia, una specie molecolare sperimenterebbe una distribuzione più sovrapposta dei valori del coefficiente di diffusione, che di solito si riflette in una caratteristica di diffusione anomala, in cui le molecole si diffondono con una relazione non lineare nel tempo19, e difficoltà nell'identificare il significato biologico di questa sottodiffusione anomala. In passato, questa difficoltà è stata in qualche modo superata registrando la diffusione molecolare da parte di FRAP da aree di varie dimensioni, piuttosto che da una sola area, fornendo così ulteriori informazioni spaziali. Ciò ha permesso, ad esempio, la concettualizzazione dei microdomini di membrana 20,21,22.
Una traduzione di questa strategia in misure FCS (cioè la cosiddetta spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot (svFCS)) è stata stabilita variando la dimensione del volume focale di osservazione, consentendo di registrare la fluttuazione della fluorescenza su diverse scale spaziali23. Pertanto, l'approccio svFCS fornisce informazioni spaziali indirette che consentono l'identificazione e la determinazione delle modalità di diffusione molecolare e del tipo di partizionamento della membrana (domini isolati rispetto a domini contigui24) delle molecole studiate. Tracciando il tempo di diffusione td in funzione delle varie scale spaziali definite dal valore di vita (ω), che corrisponde alla dimensione del raggio del fascio di rilevazione in questo caso23,25, si può caratterizzare la legge di diffusione di una data molecola in una data condizione fisiologica. L'svFCS è, quindi, un perfetto analogo al tracciamento a singola particella nel dominio del tempo26. Sotto il vincolo di diffusione browniana, ci si dovrebbe aspettare una relazione strettamente lineare tra il tempo di diffusione td e la vita ω (Figura 1)23,25. L'origine della deviazione della legge di diffusione da questo schema può essere attribuita a ragioni non esclusive, come la rete citoscheletrica, l'affollamento molecolare, il partizionamento dinamico nei nanodomini o qualsiasi combinazione di questi e altri effetti (Figura 1), e deve essere testata sperimentalmente25.
Qui forniamo tutti i checkpoint di controllo necessari per l'uso quotidiano di un sistema ottico svFCS su misura costruito da zero, che integra le nostre precedenti revisioni del protocollo27,28 su quell'approccio sperimentale. Inoltre, come prova di concetto, forniamo linee guida riguardanti la calibrazione della configurazione, la preparazione delle cellule, l'acquisizione dei dati e l'analisi per l'istituzione della legge di diffusione svFCS (DL) per Thy1-GFP, una proteina ancorata al glicosilfosfatidilinositolo della membrana plasmatica, che è nota per essere localizzata nei nanodomini della zattera lipidica29. Infine, dimostriamo come la parziale destabilizzazione dei nanodomini lipidici da parte del trattamento con colesterolo ossidasi influisca sulle proprietà di diffusione di Thy1-GFP. Inoltre, una descrizione dettagliata della costruzione di una configurazione svFCS da zero è fornita in Materiale supplementare.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aligment tool</td>
			<td>Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SPW602</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM)</td>
			<td>Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>SPCM-AQRH-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BNC 50 &#937; plug to 50 &#937; plug lead 2 m</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>742-4315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 &#937; With connector, 1.22 m, RoHS2</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>885-8172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Tee 50&#937; RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 &#8594; 1GHz</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>546-4948</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E &#8211; French Extension Lead, 230 V</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>768-5500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>452-8394</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>792-4079</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filtering</td>
			<td>535/70 ET Bandpass, AOI 0&#176; Chroma Diameter 25 mm</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F47-539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45&#176; Chroma 25.5 x 36 x 1 mm</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F43-088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0&#176; Chroma Diameter 25</td>
			<td>AHF filter</td>
			<td>F37-496</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware correlator</td>
			<td>80 MHz Digital Correlator</td>
			<td>Correlator.com</td>
			<td>Flex02-12D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW</td>
			<td>Lasos</td>
			<td>BLD-XT 488100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety</td>
			<td>High-Performance Black Masking Tape, 1&#34; x 180&#39; (25 mm x 55 m) Roll</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T743-2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MC-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG3B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope 
			Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS 
			(D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>421767-9971-711</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adapter W0.8 / M27x0.75 H &#34;5&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1698-345</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Middle ring W0.8 - W0.8 H &#34;5&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>000000-1698-347</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical path</td>
			<td>D25.4mm Mirror, Protected Silver</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25 &#181;m mounted pinhole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P25S I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>WPH10M-488 (HWP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RSP1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100B/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adjustable Prism Clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM3/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Beam block - active area 19 mm x 38 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LB1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ID25/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100CL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1&#34; Optic Holder, M4 Tap</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MFF101/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1&#34; Stackable Lens Tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stackable Lens Mount for 1&#34; optic-usable depth &#189;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Stackable Lens Mount For 1&#34;Optic-usable Depth 2&#34;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 600mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA600/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 75mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA075/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Small Optical Rails 150mm, metric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RLA150/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Carrier, Counterbored Hole 1&#34;x 1&#34;</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RC1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Carrier, Perpendicular Dovetail</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RC3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>High Precision Translating Lens Mount for 1 inch</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LM1XY/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#189; &#34; (12mm) Dovetail Translation Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DT12/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rail Clamps</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CL6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Black Rubberized Fabric</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BK5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Ball Driver kit/ 6 tools</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BD-KIT/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP6M4M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lens Mount for 25.4mm optic</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LMR1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SM1 FC/APC Adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1FCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KM100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S120C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, 
			L=50 mm, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH50/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH20/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR50/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR75/M-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>USB Power and Energy Meter Interface</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100USB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR30/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, 
			M6-Tapped Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR20/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>750 mm long Structural Rail (detection box)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25L750/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>350 mm long Structural Rail (detection box)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25L350/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Quick Corner Cube for 25 mm Rails</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25W3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Right-Angle Bracket for 25 mm Rails</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25A90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Black posterboard 20&#34; x 30&#34; (508 mm x 762 mm), 1/16&#34; (1.6 mm) Thick, 5 Sheets</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TB5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hinge for 25 mm Rail Enclosures</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>XE25LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>M4 Cap Screw Kit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HW-KIT1/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>M6 Cap Screw Kit and Hardware kit</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HW-KIT2/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Table Clamp, L-Shape, 5 Pack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CL5-P5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (&#216;0.8 - &#216;12 mm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1D12D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&#216;1&#34; SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/&#216;1 mm Hole</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DG10-1500-H1-MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Honeycomb Optical Table Top, Standa</td>
			<td>Standa</td>
			<td>1HB10-15-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Optical Table support, Standa</td>
			<td>Standa</td>
			<td>1TS05-12-06-AR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample nano-positionning</td>
			<td>Precision XYZ Nanopositioning</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>PI P527-3.CD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V 
			Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors,</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>PI E727-3.CD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature chamber</td>
			<td>Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dual Channel Microprocessor Temperature Controller</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_MTC_2000_DUO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Two Vibration Free Heater Modules</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_150_VF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PT100 Temperature Sensor</td>
			<td>Digital Pixel</td>
			<td>DP_P100_TS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture and transfection</td>
			<td>Cos7 cells</td>
			<td>ATCC&#174;</td>
			<td>CRL-1651&#8482;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>8- well Lab-Tek chambers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155411PK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PolyJet Transfection Reagent</td>
			<td>SignaGen Laboratories</td>
			<td>SL100688</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol content measurement</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12216</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>87786</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78420</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ROTI Nanoquant Working Solution</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K880</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>GloMax Discover Microplate Reader</td>
			<td>Promega</td>
			<td>GM3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>svFCS measurements</td>
			<td>HBSS buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hepes buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Cholesterol oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8868</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83697-1G</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot variation fluorescence correlation spectroscopy for analysis of molecular diffusion at the plasma membrane of living cells

I processi biologici dinamici nelle cellule viventi, compresi quelli associati all'organizzazione della membrana plasmatica, si verificano su varie scale spaziali e temporali, che vanno rispettivamente dai nanometri ai micrometri e dai microsecondi ai minuti. Una gamma così ampia di processi biologici sfida gli approcci convenzionali alla microscopia. Qui, descriviamo in dettaglio la procedura per l'implementazione di misurazioni di spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot (svFCS) utilizzando un microscopio a fluorescenza classico che è stato personalizzato. Il protocollo include uno specifico controllo delle prestazioni del setup svFCS e le linee guida per le misure di diffusione molecolare da parte di svFCS sulla membrana plasmatica di cellule viventi in condizioni fisiologiche. Inoltre, forniamo una procedura per interrompere i nanodomini della zattera della membrana plasmatica mediante il trattamento della colesterolo ossidasi e dimostriamo come questi cambiamenti nell'organizzazione laterale della membrana plasmatica potrebbero essere rivelati dall'analisi svFCS. In conclusione, questo metodo basato sulla fluorescenza può fornire dettagli senza precedenti sull'organizzazione laterale della membrana plasmatica con l'appropriata risoluzione spaziale e temporale.

Abbiamo generato un DL per Thy1-GFP espresso in celle Cos-7 (Figura 4, quadrati neri). La legge di diffusione ha un valore t 0 positivo (19,47 ms ± 2 ms), indicando che Thy1-GFP è confinato in strutture nanodominio della membrana plasmatica. Il trattamento con colesterolo ossidasi delle cellule che esprimono Thy1-GFP ha comportato lo spostamento del valore DL t0 a 7,36 ± 1,34 ms (Figura 4, quadrati grigi). Questa osservazione conferma che la natura del confinamento Thy1-GFP dipende dal contenuto di colesterolo ed è associata a nanodomini di zattera lipidica. Queste due leggi di diffusione si sono dimostrate diverse secondo il test statistico sopra descritto (vedi punto 9.1.3) in termini di valori t0 e Deff. Inoltre, abbiamo valutato la concentrazione di colesterolo cellulare totale nelle cellule Cos-7 non trattate rispetto alle cellule trattate con COase. Una piccola, ma significativa, diminuzione del contenuto di colesterolo totale è osservata durante il trattamento con COase (Figura 5). Poiché questo enzima agisce solo sul pool di colesterolo accessibile al foglietto esterno della membrana plasmatica, assumiamo che la diminuzione osservata del colesterolo sia associata solo alla membrana plasmatica e si traduca nella destabilizzazione dei nanodomini della zattera lipidica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg"> Figura 1: Leggi di diffusione della spettroscopia di correlazione di fluorescenza simulata (FCS) stabilite da FCS a variazione spot per diverse forme di organizzazione della membrana. (Pannelli superiori) Rappresentazione schematica dell'organizzazione della membrana - (A) diffusione libera, (B) barriere a rete e (C) confinamenti trappola / dominio - con la traiettoria disegnata per una singola molecola (rosso). I cerchi blu denotano l'intersezione della membrana e del raggio laser della vita ω. (Pannelli inferiori) Leggi di diffusione FCS rappresentate tracciando il tempo di diffusione td in funzione del raggio quadrato ω2. La proiezione della legge di diffusione (linea tratteggiata verde) intercetta l'asse temporale a (A) l'origine (t0 = 0) nel caso di diffusione libera; (B) in asse negativo (t0 < 0) quando ci sono barriere a maglie, o (C) in asse positivo (t0 > 0) quando ci sono trappole e domini (zattere lipidiche). D è il coefficiente di diffusione laterale per il moto browniano; Deff, il coefficiente di diffusione effettivo; Dmicro, il coefficiente di diffusione microscopico all'interno delle trappole a maglie; Din, il coefficiente di diffusione all'interno dei domini; Dout, il coefficiente di diffusione al di fuori dei domini; L, la dimensione del lato di un dominio quadrato; e rD, il raggio di un dominio circolare. Questa figura è stata modificata da He e Marguet6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg"> Figura 2: Visualizzazione schematica del controllo hardware svFCS. Il computer controlla tutti i dispositivi attraverso diversi protocolli di comunicazione: seriale (microscopio, otturatore esterno), USB (stadio piezoelettrico XYZ, correlatore) e PCI (scheda di acquisizione). DAQ: scheda di acquisizione dati, APD: fotodiodo a valanga, SPCM: modulo di conteggio a singolo fotone, DO: uscita digitale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg"> Figura 3: Vista schematica dei percorsi ottici di eccitazione ed emissione della configurazione svFCS. La configurazione svFCS contiene quattro moduli: (1) l'uscita di un laser a fibra da 488 nm è collimata, (2) una combinazione di una piastra a mezza onda e di uno splitter a fascio polarizzante imposta la potenza ottica, (3) il raggio laser focalizzato sul campione dopo aver viaggiato attraverso un microscopio motorizzato privo di lenti tubolari e (4) la fluorescenza viene rilevata attraverso un percorso di rilevamento simile a quello confocale su un fotodiodo a valanga accoppiato a un singolo modulo di conteggio dei fotoni, che fornisce un segnale a un correlatore hardware. La semplicità conferisce al sistema sensibilità, robustezza e facilità d'uso (ampiamente commentata nel materiale supplementare). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg"> Figura 4: Le leggi di diffusione svFCS generate dall'analisi di diffusione di Thy1-GFP espresse in Cos-7. leggi di diffusione svFCS delle cellule Cos-7 senza trattamento (NT, quadrati neri) e dopo trattamento con colesterolo ossidasi (COasi, cerchi grigi). L'inserto nel grafico rappresenta la verifica statistica di una differenza significativa tra le due leggi di diffusione svFCS presentate (secondo Mailfert et al.28). Il valore di prova (T) deve essere superiore alla soglia impostata a 3,8 quando entrambe le leggi di diffusione sono diverse. Più è alto, maggiore è la differenza tra le leggi di diffusione. Il valore di T è codificato a colori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg"> Figura 5: Confronto del contenuto di colesterolo totale nelle cellule Cos-7. Le cellule Cos-7 sono state non trattate (NT) o trattate con 1 U / mL di colesterolo ossidasi (COasi) per 1 ora. I dati rappresentano un esempio di un esperimento in triplice copia. Un t-test a due code e spaiato è stato utilizzato per valutare la differenza statistica (α = 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella dei materiali: Elenco degli elementi ottici necessari per la configurazione svFCS.
Materiale supplementare: Questo documento descrive la creazione di una configurazione svFCS da zero. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

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Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Questo articolo si propone di presentare un protocollo su come costruire un microscopio per spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot (svFCS) per misurare la diffusione molecolare sulla membrana plasmatica delle cellule viventi.

Spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot per l'analisi della diffusione molecolare sulla membrana plasmatica di cellule viventi

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

2.6K Views.  Aix Marseille Univ. Questo articolo si propone di presentare un protocollo su come costruire un microscopio per spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot (svFCS) per misurare la diffusione molecolare sulla membrana plasmatica delle cellule viventi.

Video: Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

PI(4,5)P2 regulates various cellular functions, but its nanoscale organization in the cell plasma membrane is poorly understood. By labeling PI(4,5)P2 with a dual-color fluorescent probe fused to the Pleckstrin Homology domain, we describe a novel approach to study the PI(4,5)P2 spatial distribution in the plasma membrane at the nanometer scale.

Singolo-molecola di Super-Resolution Imaging di fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato nella membrana plasmatica con il romanzo fluorescenti Sonde

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

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Biochimica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize proteins, DNAs, RNAs, and their complexes can however not be predicted. Employing a broad variety of conditions is a way to increase the yield of quality diffraction crystals. Two fully automated systems have been developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, England, MRC-LMB) that facilitate crystallization screening against 1,920 initial conditions by vapor diffusion in nanoliter droplets. Semi-automated protocols have also been developed to optimize conditions by changing the concentrations of reagents, the pH, or by introducing additives that potentially enhance properties of the resulting crystals. All the corresponding protocols will be described in detail and briefly discussed. Taken together, they enable convenient and highly efficient macromolecular crystallization in a multi-user facility, while giving the users control over key parameters of their experiments.

Automated systems and protocols for the routine preparation of a large number of screens and nanoliter crystallization droplets for vapor diffusion experiments are described and discussed.

Automatizzato di protocolli per cristallizzazione macromolecolare al MRC Laboratorio di biologia molecolare

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

Trasporto dell'elettrone di miotubi C2C12 Trans-Plasma membrana di misura

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

Microgravimetry dissipativo per studiare la dinamica di associazione del fosfolipide proteina Annessina A2 a lipidici solido-supportato utilizzando un risonatore al quarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

Analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

Traduzione della purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per l'isolamento dell'RNA dalle cellule endoteliali In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...