Zaman içinde bu protokollerin geliştirilmesine katkıda bulunan Kim Lab'ın önceki ve mevcut üyelerine teşekkür ederiz. Temsili veriler P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Amerika Birleşik Devletleri ve P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Amerika Birleşik Devletleri tarafından mümkün kılınmıştır. Bu yayın, kısmen Kurumsal Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmeti Ödülü'nden GM135134 T32 Hibe Numarası ile mümkün olmuştur.

Hayvan protokolleri, Rochester Üniversitesi'ndeki Üniversite Hayvan Kaynakları Komitesi tarafından onaylandı. Bu çalışmadaki fareler, Rochester Üniversitesi hayvan tesisinin patojen içermeyen alanında tutuldu. Bu çalışma için 6-12 haftalık (15-30 g) erkek / dişi C57BL / 6 fareleri kullanıldı. Fare dokusu izolasyonu, elleri örtmek için eldivenler ve burun ve ağzı kapatmak için bir yüz maskesi ile bir tezgah üzerinde veya bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilebilir. Tüm hücre kültürü ve plaka hazırlığı bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. CD8 + T hücresi saflaştırma ve aktivasyonu
<ol><li>Malzemelerin hazırlanması<ol><li>CD8 + T hücrelerinin negatif seçimi için: Sırasıyla anti-CD4 ve anti-MHCII üreten hibridoma hücre hatları GK1.5 ve M5 / 114 antikorlarının süpernatantından negatif bir seçim ortamı hazırlayın. Süpernatanı 1:1 oranında karıştırın, süzün ve ileride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın (her antikordan >0.5 μg / milyon toplam hücre). Alternatif olarak, ticari CD8 + T hücre izolasyon kitleri mevcuttur.</li>
		<li>T hücrelerinin aktivasyonu için: 1x DPBS'de (kalsiyum ve magnezyum olmadan) 500 μL CD3 (10 μg/mL) ve CD28 (16 μg/mL) antikorlarını doku kültürü (TC) ile muamele edilmiş 24 oyuklu bir plakaya ekleyin ve plakanın bağlanmasını sağlamak için gece boyunca 4 ° C'de saklayın. NOT: Antikorlar ve proteinler, TC ile muamele edilmemiş kültür plakalarını/tabaklarını normal TC ile muamele edilenlerden daha iyi kaplar, bu nedenle TC ile muamele edilmemiş kültür plakaları T hücresi üretimi için kullanılır.</li>
	</ol></li>
	<li>Tabağa 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirerek 10 cm'lik bir kültür kabı (veya eşdeğeri) hazırlayın ve filtreye 2 mL R9 ortamı dağıtın (R9 ortamı: %10 FBS ile desteklenmiş RPMI 1640x, %1 antibiyotik-antimikotik, 20 mM HEPES tamponu, %1 MEM esansiyel olmayan amino asitler, 50 μM β-merkaptoetanol).</li>
	<li>Deneysel tasarım tarafından belirlenen uygun genetik geçmişe, cinsiyete, yaşa ve kiloya sahip bir fare elde edin.</li>
	<li>Fareyi CO2 kullanarak ötenazi yapın, ardından servikal çıkık veya yerel hayvan bakımı ve kullanım protokolleri tarafından tanımlanan ve kurum tarafından onaylanan uygun ötenazi stratejileri uygulayın.</li>
	<li>Fareyi sırtüstü pozisyona getirin, dört uzvunu da vücuda dik olarak gerin ve ayak pedlerini fare diseksiyon T pimleri veya eşdeğerini kullanarak bir diseksiyon tahtasına sabitleyin. Fare cerrahi diseksiyon makası ile ventral alt karın bölgesindeki kutanöz tabakadan yüzeysel, merkezi bir kesi yapın ve çeneye kadar düz bir şekilde kesin (~ 8 cm). Lenf düğümlerini ortaya çıkarmak için cildi peritoneal astardan ayırın. Cildi gövdeden dik olarak gerin ve sabitleyin5.<ol><li>Künt forseps (veya standart bir fare cerrahi diseksiyon kitinden tercih edilen tip) kullanarak servikal, eksenel, brakiyal ve kasık lenf düğümlerini bilateral olarak nazikçe eksize edin. Adım 1.2'de hazırlanan hücre süzgecine aktarın.</li>
		<li>Peritonu açın ve dalağı çıkarın. Adım 1.2'de hazırlanan hücre süzgecine aktarın.</li>
		<li>Fare karkasını uygun biyolojik tehlike kabına atın.</li>
	</ol></li>
	<li>Doku bozma aletini tekrar tekrar saat yönünde ve saat yönünün tersine yarım tur çevirerek, adım 1.2'den itibaren 2 mL R9 ortamı ile 70 μm hücre süzgeci üzerinde mekanik bozulma yoluyla ikincil lenfoid dokuların tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlayın. NOT: 3 mL veya 10 mL luer kilitli bir şırınganın piston ucu, dokuyu ezmek ve homojenize etmek için iyi çalışır. Kullanıcının takdirine bağlı olarak alternatif malzemeler kullanılabilir.</li>
	<li>Hücreleri, şırınga ucunu, süzgeci ve kültür kabını 7 mL ortamla yıkayın, böylece tek hücreli süspansiyona bulunabilecek daha büyük doku parçalarının veya hücresel agregaların transferini önlemek için süzgecin dik kalmasını sağlayın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında (20 ° C) 270 x g'da 5 dakika boyunca pelet haline getirin ve süpernatanı boşaltın.</li>
	<li>Kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için 1 dakika boyunca 500 μL lizasyon tamponu ekleyin. 9.5 mL R9 ortamı ile seyreltin ve 270 x g'da (20 ° C) 5 dakika döndürün. Süpernatanı boşaltın.</li>
	<li>Pelet, anti-MHCII ve anti-CD4 içeren önceden hazırlanmış negatif seçim ortamının 10 mL'sinde yeniden süspanse edin (adım 1.1.1). Oda sıcaklığında (20 °C) 30 dakika boyunca kayalayın.</li>
	<li>Hücreleri 5 dakika boyunca 270 x g'da pelet haline getirin ve süpernatanı boşaltın. 3x'i 10 mL R9 ortamı ile yıkayın.</li>
	<li>Eşzamanlı olarak, 15 mL'lik bir konik tüpte, 200 μL koyun sıçan önleyici IgG boncuklarını 7 mL ortamda yıkayın. Tüpü bir mıknatısın üzerine yerleştirin, ortamı çıkarın ve yıkama adımını iki kez tekrarlayın. Boncukları 7 mL R9 ortamında yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücreleri 5 dakika boyunca 270 x g'da (20 ° C) pelet haline getirin, süpernatantı boşaltın ve ardından peleti adım 1.13'ten itibaren 7 mL boncuk süspansiyonunda yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında (20 °C) 45 dakika bekletin.</li>
	<li>CD8 + T hücrelerini manyetik boncuk tükenmesi ile zenginleştirin. Antikor / boncuk bağlı hücreleri çıkarmak için konik tüpü 3 dakika boyunca kapaksız olarak doğrudan mıknatısın üzerine yerleştirin. CD8 + hücreleri korunmalıdır. Tüp hala mıknatısın içindeyken, serolojik bir pipet veya eşdeğeri kullanarak hücre süspansiyonunu toplayın ve yeni bir 15 mL tüpe aktarın. 270 x g'da (20 °C) 5 dakika santrifüjleyin ve 3 kez orta derecede yıkayın.</li>
	<li>Önceden kaplanmış aktivasyon plakasını (adım 1.1.2) plakanın alt yüzeyine doğrudan pipetlemeden 1x DPBS ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>İsteğe bağlı: Ölü hücreleri çıkarmak için canlı/ölü lenfosit ayrımı yapın.<ol><li>Hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunun altına yavaşça 2 mL lenfosit ayırma ortamı ekleyin. Düşük hızlanma ve yavaşlamada 10 dakika (oda sıcaklığında) 900 x g'da santrifüjleyin. NOT: Canlı hücreler, ortam ve ayırma ortamının (ortadaki beyaz katman) arayüzünde ayrılacaktır. Ölü hücreler tüpün dibinde topaklanır ve sonunda atılabilir.</li>
		<li>Canlı lenfositleri içeren orta tabakayı yeni bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 270 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın.</li>
	</ol></li>
	<li>Peletleri 10 U / mL rekombinant fare IL-2 ile 12 mL ortamda yeniden süspanse edin. TC ile muamele edilmemiş 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 1 mL plaka ve gece boyunca 37 ° C'ye aktarın.</li>
</ol>2. Aktive edilmiş CD8 + T hücrelerinin kaldırılması
<ol><li>4x veya 10x objektifi kullanarak standart bir tezgah üstü ışık mikroskobu kullanarak hücreleri görselleştirin. NOT: Aktive edilmiş T hücreleri, inaktive edilmiş T hücrelerine kıyasla daha büyük ve yuvarlak veya uzun görünecektir ve kuyu boyunca yoğun hücre kümelerine sahip olmalıdır.</li>
	<li>Aktive olmuş hücreleri kaldırmak için, hücreleri 1 mL'lik bir pipetle parçalayın ve plakanın kenarlarında iyice karıştığından emin olun. Hücreleri 15 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın. NOT: Etkinleştirilmiş hücreler daha yapışkandır ve daha güçlü pipetleme gerektirir.</li>
	<li>Kalan hücreleri çıkarmak için kuyuları 1 mL R9 ortamı ile yıkayın. Gerekirse bir kez daha tekrarlayın. Hücreleri 270 x g'da (20 ° C) 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.</li>
	<li>Adım 1.17-1.18'de olduğu gibi ölü hücreleri çıkarmak için canlı / ölü lenfosit ayrımı yapın.</li>
	<li>TC olmayan 6 oyuklu bir plakada IL-2 ile R9 ortamında her 3-4 günde bir canlı / ölü hücre temizliği ile T hücrelerini koruyun. NOT: T hücreleri, muhtemelen aktivasyonlarına yardımcı olan T hücresi-T hücresi temasları veya T hücresi kaynaklı çözünür faktörler nedeniyle, erken aktivasyon sırasında küçük boyutlu kuyularda daha iyi çoğalır. Hızlı T hücresi proliferasyonu, kültür ortamının kültürden 24-48 saat sonra sararmasına neden olur. Bu noktada, hücreleri kaldırın ve hücreleri, hücreleri beslemek için yeterli taze kültür ortamı (tipik olarak kuyucuk başına 5 mL) ile daha büyük bir kuyuya (kaplanmamış, TC olmayan 6 oyuklu plaka) aktarın. Tükenmiş ortamı, sarı orta renk değişimi ile belirtildiğinde veya her 3-4 günde bir taze ile değiştirin.</li>
</ol>3. Cam tabağın hazırlanması
<ol><li>Gece boyunca 4 °C'de 300 μL/cm2 Protein A (0.1 mg/mL) ile kaplayarak cam hücre migrasyon odalarını veya plakalarını hazırlayın, bir sonraki adıma geçmeden önce tabağa dağıtarak ve boşaltarak 1x DPBS ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Göç odasını veya plakasını 300 μL / cm2 rekombinant fare ICAM-1 veya VCAM-1 Fc kimera (0.1-2.75 mg / mL) ile rekombinant fare kemokini (0.1-10 μg / mL) ile kaplayın oda sıcaklığında 2-3 saat. Fibronektin, fare kollajen IV ve fare E-kaderin gibi diğer integrin ligandları, 4 ° C'de gece boyunca 2.5-10 μg / mL'de odayı doğrudan kaplamak üzere işlenir.<ol><li>Hücreleri eklemeden önce tabağa dağıtarak ve hemen ardından boşaltarak hazneleri 1x DPBS ile iki kez yıkayın. NOT: T hücreleri, aktivasyon, farklılaşma, duyarlılaşma ve hazırlama durumuna bağlı olarak farklı integrin ligandları ve kemokin konsantrasyonlarında farklı şekilde göç edebilir. Birden fazla farklı konsantrasyonda hücre göçünün test edilmesi şiddetle tavsiye edilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kanser hücrelerinin T hücresi öldürmesini gerçek zamanlı olarak ölçmek için T hücrelerini kanser hücreleri gibi diğer hücrelerle birlikte kültürlüyorsanız, görüntülemenin başlamasından 24 saat önce yapışık hücreleri cam kaplı plakalar üzerine yerleştirin.</li>
</ol>4. Hücrelerin hazırlanması
<ol><li>İsteğe bağlı: T hücrelerini ve yapışkan hücreleri, 37 °C'de 15 dakika boyunca 1x DPBS'de 1 x 107 hücre başına 1 μg/mL'de tercih edilen hücre izleyici boyası ile boyayın.</li>
	<li>Bir hemositometre veya eşdeğeri kullanarak hücreleri sayın.</li>
	<li>Plaka: 1 x 10,5 CD8 + Leibovitz'in L-15 ortamındaki T hücreleri (veya istenen miktar), 37 ° C'lik bir odada 1-5 g / L glikoz ile desteklenmiştir. NOT: L-15 ortamı, CO2-sodyum bikarbonat sistemi olmadan kullanım için formüle edilmiştir. PH seviyelerini korumak için serbest bazik amino asitler, fosfat tamponları ve galaktoz kullanılarak tamponlanır.</li>
	<li>İsteğe bağlı: İntegral engelleme gerçekleştirin.<ol><li>T hücrelerini bir integrine (1-10 μg/mL, anti-fare CD11a (M17/4), anti-fare CD18 (M18/2), anti-fare VLA-4'e (9C10) karşı bloke edici bir antikor ile 10 dakika önceden inkübe edin ve aynı antikorun varlığında taramaya bırakın.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Hızlandırılmış mikroskopi
<ol><li>Video mikroskobu yapın.</li>
	<li>T hücreleri için, 10-60 dakika boyunca her 10-60 saniyede bir parlak alan ve floresan görüntüler veya istenen çekim ayarları elde edin. NOT: T hücresi göçü sıcaklığa duyarlıdır ve fare T hücresi göçü için en uygun sıcaklık 37 °C'dir. Bu protokolün kullandığı sıcaklık kontrol sistemi, bağlı bir ısıtma sistemine sahip kapalı ve yalıtımlı bir mikroskop güvertesinden oluşur. Görüntüleme odası, görüntüleme güvertesine oturur. Bu odanın çevresi, görüntüleme sırasında tutarlı ısı ve neme izin veren damıtılmış su ile doldurulmuş bir kuyuya sahiptir. Mikro kuyu, görüntüleme odasının merkezine yerleştirilmiştir.</li>
</ol>6. T hücresi göçünün yazılım destekli analizi
<ol><li>T hücresi göçünü değerlendirmek için Volocity yazılımını kullanın.<ol><li>Volocity'yi açın ve yeni bir görüntü dizisi oluşturun.</li>
		<li>Tüm zaman atlamalı video mikroskobu filmlerini seçin ve Volocity'deki mavi alana taşıyın.</li>
		<li>Kontrast geliştirme aracını kullanarak parlaklığı ve kontrastı araştırmacının istediği ayarlara ayarlayın.</li>
		<li>Görüntü boyutlarını kontrol edin: 20x için 0,325 μm, 10x için 0,65 μm.</li>
		<li>Sıra: zaman noktalarını ayarlayın (ör. 20 dakika boyunca her 15 saniyede bir görüntü çekiyorsanız 81 görüntü, dakikada 4 görüntü).</li>
		<li>Ölçüm sekmesindeki tüm zaman noktalarının işaretini kaldırın.</li>
		<li>Yoğunluğu kullanarak nesneleri bulun - çubuğu zirvenin tam sağında olacak şekilde kaydırın.</li>
		<li>Nesneleri boyuta göre hariç tutun: hücre kalıntılarını veya hücresel olmayan parçacıkları dışlamak için çapı 10 μm'den küçük ve 100 μm'den büyük tüm hücreler. Kayıt süresinin %20'sinden daha az bir süre boyunca geçiş yapan T hücrelerini hariç tutun (bu, her araştırmacının tanımına bağlı olarak değişebilir).</li>
		<li>Statik nesneleri yoksay (onay kutusu).</li>
		<li>Bozuk yolları otomatik olarak birleştir (onay kutusu).</li>
		<li>En kısa yolu 20 μm'den fazla olmayacak şekilde ayarlayın.</li>
		<li>Bir hücre göçünün izi, aynı hücrenin zaman içindeki konumunu birbirine bağlayan çizgidir. İzleme algoritmasının, her bir karede segmentasyon ile tek tek nesnelerin nerede algılandığını algılayarak izleme yaptığından ve nesnelerin çerçeveler arasında eşleştirildiğinden emin olun.</li>
		<li>Ölçümler > Protokolü Kaydet > Yeni Protokol Adlandır'ı seçerek yeni bir protokol kaydedin.</li>
		<li>Ölçüm sekmesinde tüm zaman noktalarını ölç'e tıklayın.</li>
		<li>Parçaları zaman aralığına göre, yüksekten düşüğe doğru sıralayın.</li>
		<li>Araştırmacı tarafından tanımlandığı şekilde iyi izlere sahip tüm hücreler için parça kimlik numaralarını kaydedin. Otomatik hücre izlemeden sonra, yanlış tanımlanmış veya bozuk izleri dışlamak için her hücre izinin manuel olarak değerlendirilmesi gerekir. Kötü izlere sahip hücreleri hariç tutun.</li>
		<li>Dosyayı virgülle ayrılmış metin olarak dışa aktarın ve verileri istenen analiz yazılımına aktarın. NOT: Temel parametreler: Hız (μm/dak), yer değiştirme (net hareket, μm), iz uzunluğu (toplam yol uzunluğu, μm) ve kıvrım indeksi (MI; net yer değiştirme/iz uzunluğu. MI = 1 tamamen düz bir doğrusal izi gösterir).</li>
	</ol></li>
	<li>Image J'yi kullanarak manuel izleme gerçekleştirin.<ol><li>Eklentileri açın ve izleme ve manuel izlemeyi seçin. Parametreleri ayarlayın - zaman aralıkları, x/y kalibrasyonu (piksel boyutu) ve z kalibrasyonu (manuel izleme modunda). İz ekle'ye tıklayarak, ilk zaman noktasında bir hücre seçerek ve tüm zaman noktalarında devam ederek tek tek hücre izlemeyi başlatın. Ardından, Parçayı sonlandır'a tıklayın. İlgilendiğiniz tüm hücreler için tekrarlayın. NOT: Hücre takibi için başka bir araç olan Trackmate, ImageJ eklentisi aracılığıyla kullanılabilen otomatik bir izleme yazılımıdır.</li>
	</ol></li>
</ol>

T-Hücresi Kinetiğinin Aydınlatılması: Gerçek Zamanlı Migrasyon Analizi Yöntemleri

<ol>
	<li>Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+in+health+and+disease.">T cells in health and disease.</a> Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).</li><li>Fowell, D. J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatio-temporal+control+of+effector+T+cell+migration.">The spatio-temporal control of effector T cell migration.</a> Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).</li><li>Tabdanov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+t+cells+to+enhance+3d+migration+through+structurally+and+mechanically+complex+tumor+microenvironments.">Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments.</a> Nat Commun. 12 (1), 2815 (2021).</li><li>Kameritsch, P., Renkawitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+leukocyte+migration+strategies.">Principles of leukocyte migration strategies.</a> Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).</li><li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+naive+CD4++T+cell+isolation+and+in+vitro+differentiation+into+t+cell+subsets.">Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets.</a> J Vis Exp. (98), e52739 (2015).</li><li>Sailer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pd-1(hi)+CAR-T+cells+provide+superior+protection+against+solid+tumors.">Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors.</a> Front Immunol. 14, 1187850 (2023).</li><li>Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+integrin+mac-1+in+vivo.">Visualization of integrin mac-1 in vivo.</a> J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).</li><li>Lim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+trails+guide+influenza-specific+CD8++T+cells+in+the+airways.">Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways.</a> Science. 349, 4352 (2015).</li><li>Lim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+neutrophil+efferocytosis+shapes+T+cell+immunity+to+influenza+infection.">In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection.</a> Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).</li><li>Reilly, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T(rm)+integrins+CD103+and+CD49a+differentially+support+adherence+and+motility+after+resolution+of+influenza+virus+infection.">T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).</li><li>Amitrano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+CD8(+)+T+cell+metabolism+and+effector+functions.">Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions.</a> Front Immunol. 12, 666231 (2021).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+t-cell+migration.">Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).</li><li>Capece, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+intracellular+pool+of+IFA-1+is+critical+for+asymmetric+CD8(+)+T+cell+activation+and+differentiation.">A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation.</a> J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).</li><li>Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+and+function+of+memory+CD8(+)+T+cells+in+skin.">Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin.</a> J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).</li><li>Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cytolytic+T+cell+differentiation+and+granule+exocytosis+with+T+cells+from+mice+expressing+active+fluorescent+granzyme+B.">Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B.</a> PLoS One. 8 (6), e67239 (2013).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neutrophil+chemotaxis.">Analysis of neutrophil chemotaxis.</a> Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).</li><li>Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+signaling+hierarchy+determines+direction+of+migration+in+opposing+chemotactic+gradients.">An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients.</a> J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J Cell Biol. 75 (2), 606-616 (1977).</li><li>Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+microfluidic+device+for+the+study+of+cell+migration+during+chemotaxis.">Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis.</a> Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).</li><li>Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IL+sequence+in+the+LLKIL+motif+in+CXCR2+is+required+for+full+ligand-induced+activation+of+Erk,+Akt,+and+chemotaxis+in+HL60+cells.">The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells.</a> J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).</li><li>Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhausted+mature+dendritic+cells+exhibit+a+slower+and+less+persistent+random+motility+but+retain+chemotaxis+against+ccl19.">Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19.</a> Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).</li><li>Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+crawling+in+capillaries:+A+novel+immune+response+to+staphylococcus+aureus.">Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004379 (2014).</li><li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration+within+a+three-dimensional+collagen+matrix.">Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix.</a> J Vis Exp. (92), e51963 (2014).</li><li>Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+migration+does+not+follow+a+random+walk.">Three-dimensional cell migration does not follow a random walk.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).</li><li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Overstreet, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+interstitial+migration+of+effector+CD4(+)+T+cells+is+dependent+on+integrin+&#945;v.">Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin &#945;v.</a> Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).</li></ol>

Yazarlar, tüm araştırma ve makale hazırlığının, potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan eder.

İn vivo olarak yakınsak sinyallerin biyolojik etkisini anlamak zordur ve yorumlanması kolay değildir. Burada sunulan protokoller, yüksek düzeyde tanımlanmış ve biyolojik olarak ilgili koşullarda T hücresi göçünü anlamak için makul bir yöntem sağlar. Bu koşullar, araştırmacının takdirine bağlı olarak belirlenebilir ve protokoller, çeşitli T hücresi popülasyonlarının, aktivasyon durumunun ve hücre fenotipinin ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilebilir. Ayrıca, birçok ligan...

T hücreleri, adaptif, antijene özgü immün yanıtın ana efektörleridir. Popülasyon düzeyinde, T hücreleri heterojendir ve farklı özel işlevlere sahip hücresel alt kümelerden oluşur. Daha da önemlisi, CD8 + T hücreleri, enfekte olmuş veya işlevsiz hücreleri doğrudan ortadan kaldıran bağışıklık sisteminin ana sitolitik efektörleridir1.
Olgun CD8 + T hücreleri dokuda bulunur ve antijen aramak için kan ve lenfatiklerde dolaşır. Enfeksiyon sırasında, T hücreleri kan veya dokuda antijenlerle sunulur ve üretken bir bağışıklık tepkisi başlatmak için hızla dalağa veya en yakın drenaj lenf noduna boşalır. Her iki durumda da, T hücreleri aktive olur, klonal genişlemeye uğrar ve lenfatik sistemi zaten orada değilse, kana girmek için terk eder. Bu işlem sırasında, hücre içi sinyalleme, lenfatik hedef arama reseptörlerinin aşağı regülasyonunu ve dokuya özgü göç için gerekli olan çok sayıda integrin ve kemokin reseptörünün yukarı regülasyonunu sağlar2. Sonuç olarak, T hücrelerinin enfeksiyon bölgelerine yönlendirilmiş göçü, integrin ve kemokin sinyalini içeren yakınsak çevresel sinyaller tarafından yönlendirilir.
Kemokinler genel olarak iki ana sınıfa ayrılabilir: (1) farklılaşma, sağkalım ve bazal fonksiyon için gerekli olan homeostatik sinyaller ve (2) kemotaksis için gerekli olan CXCL9, CXCL10 ve CCL3 gibi inflamatuar sinyaller. Genel olarak, kemokinler, integrin ekspresyonu1'i aktive etmenin yanı sıra, kemotaksis olarak bilinen yönlü göçü yönlendiren bir sinyal gradyanı oluşturur. Kemotaksis, onları belirli bir yöne veya konuma yönlendirebilecek gradyandaki küçük değişikliklere yanıt verebilen T hücreleri ile hassas bir şekilde düzenlenir ve oldukça hassastır.
Bu T hücresi ile ilgili faktörlere ek olarak, migrasyon ayrıca hücre dışı matris (ECM) bileşimi ve yoğunluğundan da etkilenir. ECM, T hücreleri üzerindeki yapışkan integrin reseptörleri için iskele sağlayan kollajen ve proteoglikanlar dahil olmak üzere yoğun bir protein ağından oluşur. İntegrinler, her biri son derece uzmanlaşmış bağlanma alanlarına ve aşağı akış sinyalleme etkilerine sahip çeşitli bir transmembran protein ailesidir. Bir T hücresinin yüzeyindeki integrin reseptörlerinin dinamik ekspresyonu, değişen ortamlarına hızlı adaptasyon sağlar3. Daha da önemlisi, integrinler, T hücresi hareketi için gerekli itme kuvvetini üretmek için birlikte çalışan ECM ve hücre içi hücre içi iskelet aktin ağlarını birbirine bağlar.
Özetle, göç modelleri bağışıklık hücresi fenotipine veya çevresel sinyallere göre değişir. Bu karmaşık biyolojik süreçler, T hücresinin, çevreleyen hücrelerin ve lokal, enfekte olmuş dokunun yüzeyindeki sitokinlerin, kemokinlerin ve integrinlerin ekspresyonu ile sıkı bir şekilde düzenlenir. İn vivo, bu göç mekanizmaları karmaşık olabilir ve birkaç katkı sinyalindenkaynaklanabilir 4. Bu karmaşıklık nedeniyle, görünüşte birbirine kenetlenmiş değişkenler arasında nedensel bir ilişki kurmak imkansız olabilir. Bunun üstesinden gelmek için, spesifik kemokin sinyallerine yanıt ve T hücresi integrinleri ile ECM bağlayıcı proteinler arasındaki etkileşim gibi T hücresi göçünün belirli yönlerini incelemek için birkaç in vitro yaklaşım vardır. Bu protokol, iki boyutlu uzayda in vitro migrasyon testleri ve belirtilen T hücresi migrasyonunu analiz etmek için hesaplamalı analiz araçları ile murin CD8+ T hücrelerini izole etme ve aktive etme yöntemlerini ele alır. Bu yöntemler, literatürde açıklanan diğer bazı hücre göçü tahlillerinde olduğu gibi karmaşık malzemeler veya cihazlar gerektirmedikleri için kullanıcı için avantajlıdır. Bu yöntemlerle oluşturulan hücre göçü verileri, in vivo olarak daha fazla ve bilinçli araştırmayı mümkün kılan basit bir şekilde bağışıklık tepkilerinin kanıtını sağlayabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>339650</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>without calcium and without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate non-TC treated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3736</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>352350</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6KR centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Violet</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C34571</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Sorvall ST 16R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (IV)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354233</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>04200417C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Sheep anti-Rat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag 15 Magnet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy sep mouse T cell isolation kit</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>19851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>10838039001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc/</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cubes</td>
			<td>Nikon or Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GK1.5</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HQ CCD camera</td>
			<td>CoolSNAP</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/h</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ automatic tracking plug in</td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.net/TrackMate</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ manual tracking plug in</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</td>
			<td>weblink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15</td>
			<td>Various</td>
			<td>See Materials</td>
			<td>Medium Recipe: Leibovitz&#8217;s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liebovitz&#39;s L-15 medium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lok disposable syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphocyte separation medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-072-CI</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M5/114</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope heating system</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>okolab.com</td>
			<td>Custom designs available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ slide</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C86024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mojosort mouse CD8+ Na&#239;ve T cell isolation kit</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse E-cadherin</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>8875-EC-050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical dissection kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-820-096</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-TC 24wp</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R9</td>
			<td>Various</td>
			<td>See Materials</td>
			<td>Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 &#956;M &#946;-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>796-IC-050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>575410</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T pins</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S99385</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE2000-U microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Various recombinant mouse chemokine</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VCAM-1 Fc chimera</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>643-VM-050</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time in vitro migration assay for primary murine cd8+ t cells

Adaptif bağışıklık tepkisi, bir T hücresinin patojenlere ve yabancı cisimlere yanıt olarak kan, lenf ve doku yoluyla göç etme yeteneğine bağlıdır. T hücresi göçü, kemokinler, kemokin reseptörleri ve adezyon molekülleri dahil olmak üzere çevreden ve yerel bağışıklık hücrelerinden gelen birçok sinyal girişinin koordinasyonunu gerektiren karmaşık bir süreçtir. Ayrıca, T hücresi motilitesi, aktivasyon durumunu, transkripsiyonel manzarayı, adezyon molekülü ekspresyonunu ve daha fazlasını değiştirebilen dinamik çevreleyen çevresel ipuçlarından etkilenir. İn vivo, görünüşte iç içe geçmiş bu faktörlerin karmaşıklığı, T hücresi göçüne katkıda bulunan bireysel sinyalleri ayırt etmeyi zorlaştırır. Bu protokol, son derece spesifik çevresel koşullar altında T hücresi göçünü gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için T hücresi izolasyonundan bilgisayar destekli analize kadar bir dizi yöntem sağlar. Bu koşullar, göçü düzenleyen mekanizmaları aydınlatmaya, T hücresi kinetiği anlayışımızı geliştirmeye ve hayvan deneyleri yoluyla elde edilmesi zor olan güçlü mekanik kanıtlar sağlamaya yardımcı olabilir. Hücre göçünü etkileyen moleküler etkileşimlerin daha derin bir şekilde anlaşılması, gelişmiş terapötikler geliştirmek için önemlidir.

T cells are the major effectors of the adaptive, antigen-specific immune response. On a population level, T cells are heterogeneous, comprised of cellular subsets with distinct specialized functions. Importantly, CD8+ T cells are the main cytolytic effectors of the immune system, which directly eliminate infected or dysfunctional cells1.
Mature CD8+ T cells reside in tissue and circulate through blood and lymphatics in search of antigens. During infection, T cells are presented with antigens in blood or tissue and quickly drain to the spleen or nearest draining lymph node to begin a productive immune response. In either case, T cells become activated, undergo clonal expansion, and leave the lymphatic system to enter the blood, if not already there. During this process, intracellular signaling confers the downregulation of lymphatic homing receptors and the upregulation of numerous integrin and chemokine receptors essential for tissue-specific migration2. Ultimately, the directed migration of T cells to sites of infection is driven by converging environmental signals that include integrin and chemokine signaling.
Chemokines can be broadly categorized into two main classes: (1) homeostatic signals, which are essential for differentiation, survival, and basal function, and (2) inflammatory signals, such as CXCL9, CXCL10, and CCL3, which are required for chemotaxis. Generally, chemokines create a signal gradient that drives directional migration, known as chemotaxis, in addition to activating integrin expression1. Chemotaxis is finely regulated and highly sensitive, with T cells capable of responding to tiny changes in gradient that can lead them toward a specific direction or location.
In addition to these T cell-related factors, migration is also affected by the extracellular matrix (ECM) composition and density. The ECM is made up of a dense network of proteins, including collagen and proteoglycans, which provide the scaffold for adhesive integrin receptors on T cells. Integrins are a diverse family of transmembrane proteins, each with highly specialized binding domains and downstream signaling effects. Dynamic expression of integrin receptors on the surface of a T cell enables quick adaptation to their changing environments3. Importantly, integrins connect the ECM and intracellular cytoskeletal actin networks that work together to generate the propelling force required for T cell movement.
In summary, migration patterns vary based on the immune cell phenotype or environmental signals. These complex biological processes are tightly regulated by the expression of cytokines, chemokines, and integrins on the surface of the T cell, surrounding cells, and the local, infected tissue. In vivo, these migratory mechanisms can be&#160;complex and may result from several additive signals4. Due to this complexity, it can be impossible to establish a causal relationship between seemingly interlocked variables. To overcome this, there are several in vitro approaches to study specific aspects of T cell migration such as response to specific chemokine signals and the interaction between T cell integrins and ECM binding proteins. This protocol addresses methods to isolate and activate murine CD8+ T cells, with in vitro migration assays in two-dimensional space and computational analysis tools for analyzing specified T cell migration. These methods are advantageous to the user because they do not require sophisticated materials or devices, as with some other cell migration assays described in the literature. Cell migration data generated with these methods can&#160;provide evidence of immune responses in a simplistic manner that enables further, informed investigation in vivo.

Yazar Spotlight: T Hücresi Göçünün Gerçek Zamanlı Analizi ile Hastalık Mekanizmalarını Anlamak

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

The goal of our research is to understand T cell migration patterns in highly defined environmental conditions to enable informed in vitro experimentation and decipher molecular interactions impacting migration. Live imaging, such as intravital multiphoton microscopy, is used for in vivo understanding of immune cell kinetics. But microfluidic devices are a common in vitro tool that offer precise control over the microenvironment that cannot be afforded in a live specimen.Our protocol allows us to analyze intricate signaling pathways and provides better understanding for targeted in vitro experiments to further address the biological roles of individual signals in a cell type specific manner. Our method is simple, reproducible and easy to access in research labs that have a brightfield microscope featuring an attached digital camera. Therefore, our approach ensures a reliable set of methods to study dynamic cell migration events.Our lab will focus on investigating the migration of immune cells, including T cells and neutrophils in a variety of disease settings, such as tumors and infection, thereby comprehending the mechanisms that are important to regulate immune cell migration. This will help in developing the therapeutic methods to help treat and prevent disease.

T hücresi aktivasyonunun doğrulanması, murin T hücrelerinde6 kanonik aktivasyon belirteçleri olan CD69 ve CD44'ün artmış ekspresyonunu arayan akış sitometrisi ile sağlanabilir. Ek olarak, T hücresi popülasyonunun saflığı, CD3 + CD8 + T hücreleri için akış sitometrisi ile belirlenebilir. Bu yöntem %>90 CD8+ T hücre popülasyonu sağlar.
T hücresi göçü, hem tekrarlanabilir hem de araştırmacının ihtiyaçlarına...

Bu protokol, kantitatif analiz ile belirli çevresel koşullar altında primer murin T hücresi izolasyonu ve T hücresi göçünün hızlandırılmış mikroskobu için bir yöntem sağlar.

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

Araştırmamızın amacı, bilinçli in vitro deneyleri mümkün kılmak ve göçü etkileyen moleküler etkileşimleri deşifre etmek için yüksek düzeyde tanımlanmış çevresel koşullarda T hücresi göç modellerini anlamaktır. İntravital multifoton mikroskobu gibi canlı görüntüleme, immün hücre kinetiğinin in vivo olarak anlaşılması için kullanılır. Ancak mikroakışkan cihazlar, canlı bir örnekte sağlanamayan mikro çevre üzerinde hassas kontrol sağlayan yaygın bir in vitro araçtır.Protokolümüz, karmaşık sinyal yollarını analiz etmemize olanak tanır ve bireysel sinyallerin biyolojik rollerini hücre tipine özgü bir şekilde daha fazla ele almak için hedefli in vitro deneyler için daha iyi bir anlayış sağlar. Yöntemimiz basit, tekrarlanabilir ve bağlı bir dijital kameraya sahip parlak alan mikroskobuna sahip araştırma laboratuvarlarında erişimi kolaydır. Bu nedenle, yaklaşımımız dinamik hücre göçü olaylarını incelemek için güvenilir bir yöntem seti sağlar.Laboratuvarımız, tümörler ve enfeksiyon gibi çeşitli hastalık ortamlarında T hücreleri ve nötrofiller de dahil olmak üzere bağışıklık hücrelerinin göçünü araştırmaya odaklanacak ve böylece bağışıklık hücresi göçünü düzenlemek için önemli olan mekanizmaları kavrayacaktır. Bu, hastalığın tedavisine ve önlenmesine yardımcı olacak terapötik yöntemlerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.

real-time-in-vitro-migration-assay-for-primary-murine-cd8-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

731 Görüntüleme.  University of Rochester. Araştırmamızın amacı, bilinçli in vitro deneyleri mümkün kılmak ve göçü etkileyen moleküler etkileşimleri deşifre etmek için yüksek düzeyde tanımlanmış çevresel koşullarda T hücresi göç modellerini anlamaktır. İntravital multifoton mikroskobu gibi canlı görüntüleme, immün hücre kinetiğinin in vivo olarak anlaşılması için kullanılır. Ancak mikroakışkan cihazlar, canlı bir örnekte sağlanamayan mikro çevre üzerinde hassas kontrol sağlayan yaygın ...

Video: Yazar Spotlight: T Hücresi Göçünün Gerçek Zamanlı Analizi ile Hastalık Mekanizmalarını Anlamak

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.