Bu protokol önemlidir, çünkü farklı iskelet kaslarında kök hücre fonksiyonunun incelenmesini sağlar ve homeostaz, rejenerasyon ve hastalık ilerlemesine nasıl katkıda bulunduklarına dair anlayışımızı derinleştirir. Bu protokolü kullanarak, iki canlı kök hücre popülasyonunu belirli kaslardan izole edebilir ve nasıl çalıştıklarını inceleyebiliriz. Kas izolasyonuna başlamak için, ötenazi fareyi etanol ile püskürtün ve karnı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
Makas kullanarak, karın derisine 0,5 santimetre uzunluğunda yatay bir kesi yapın. Her iki elinizi kullanarak, gövdeyi ve alt ekstremiteleri arka bacaklara kadar açığa çıkarmak için cildi çekin. Gracilis veya iç uyluk kasını bulun ve bir çift kavisli forseps kullanarak üzerine tutun ve kası hafifçe kaldırın.
Makas kullanarak, gracilis kasını kesmek için 0,5 santimetrelik bir kesi yapın. Diğer bacaktaki prosedürü tekrarlayın. Bir neşter kullanarak, tibianın lateral tarafı boyunca 0,5 santimetrelik bir kesi yaparak fasyayı kesin.
Daha sonra kavisli forseps kullanarak fasyayı tutun ve arka bacağın distal ucundaki tendonları açığa çıkararak çekerek çıkarın. Daha sonra, TA'nın distal tendonu ile EDL kası arasına süper ince uçlu bir çift düz forseps yerleştirin. Forsepsleri kasların proksimal ucuna doğru kaydırarak kasları ayırın.
Forsepsleri distal uca geri getirin ve distal tendonu kesin. TA'nın distal tendonunu kavisli forseps ile yavaşça tutun ve kası yukarı ve proksimal ataşmanın üzerine kaldırın. Proksimal tendonu dikkatlice kesmek için, diğer ucu bağlantısına mümkün olan en yakın şekilde kesin ve TA'yı bir Petri kabına aktarın.
Daha sonra EDL'nin distal tendonunun altına girmek için süper ince uçlu düz forsepsleri kullanın ve kasları birbirinden ayırmak için forsepsleri kasın proksimal ucuna doğru kaydırın. Forsepsleri distal uca geri getirin ve kaslara zarar vermeden distal tendonu kesin. EDL'nin distal tendonunu kavisli forsepslerle nazikçe tutarak, proksimal tendonu ataşmanına mümkün olduğunca yakın kesmek için kası yukarı ve proksimal ataşmanı üzerine kaldırın.
Diğer ucu kesin ve EDL kasını bir Petri kabına aktarın. Diğer arka bacak için prosedürü tekrarlayın. Aşil tendonu ile alt arka bacak kemikleri arasına ulaşmak için süper ince uçlu düz forseps kullanın.
Kasları kemiklerden ayırmak için forsepsleri kasın proksimal ucuna doğru kaydırın. Forsepsleri distal uca geri getirin ve distal tendonu kesin. Gastroknemius veya GA kasını yukarı ve fibulanın üzerine çekin.
Proksimal soleus tendonunu bulmak için. Soleus ve GA kasları arasına düz forsepsleri yerleştirin ve soleusu GA'dan ayırmak için forsepsleri kasların distal ucuna doğru hareket ettirin. Şimdi proksimal soleus tendonunu kesin. Kavisli forseps ile tutun ve distal tendonuna erişmek için sous'u dikkatlice kaldırın.
Soleusu GA'dan izole etmek için distal tendonu kesin ve soleusu yıkama ortamını içeren Petri kabına yerleştirin. Sonra GA'yı kesin ve Petri kabına yerleştirin. Triseps kasını izole etmek için, triseps ve humerus kemiği arasına ulaşmak için süper ince uçlara sahip düz forseps kullanın ve kası kemikten ayırmak için forsepsleri kasın proksimal ucuna doğru kaydırın.
Daha sonra, triseps kasının distal ucunu kesin ve kavisli forseps kullanarak proksimal tendona erişmek için dirseğin üzerine ve üstüne çekin. Trisepsin proksimal tendonunu kesin ve kası bir Petri kabına aktarın. Diğer dört uzuv için prosedürü tekrarlayın.
Kürkü ve cildi çeneden çıkarmak için, gözün altında 0,5 santimetrelik bir kesi yapmak için makas kullanın ve kaudal yönde kesin. Daha sonra her iki elin başparmaklarını ve işaret parmaklarını kullanarak, insizyonun her iki tarafına sıkıştırın ve cildi yukarı ve aşağı doğru çekerek çıkarın. Masseterin ana tendonunu gözün altındaki kaudal tarafa yerleştirin ve tendonu kesmek için düz neşter bıçağını kemik ve kas arasına yerleştirin.
Büyük masseter tendonunu kavisli forseps ile tutun ve masseter kasını çene kemiğinden ayırmak için rostral yönde bir neşter bıçağı veya makasla kesin. İzole edilmiş masseter kasını Petri kabına yerleştirin ve ikinci masseter kası için prosedürü tekrarlayın. Sternumun ortasında torakotomi yapmak ve sternumu kesmek için makas kullanın.
Göğüs kafesinden 360 derece keserek diyaframı açığa çıkarın. Daha sonra üst vücudu karından ayırmak için trakea, yemek borusu, vena kava ve abdominal aortu kesmek için makas kullanın. Daha sonra, makas kullanarak, sternumun bir santimetre altında bir laparotomi hazırlayın ve yaklaşık 360 derecelik bir kesim yapın.
Kapalı makası göğüs kafesi ile karın organları arasına yerleştirin ve aşağı doğru bastırın. Karın organlarından ayırmak için göğüs kafesini yavaşça çekin. Diyaframı göğüs kafesinden ayırmak için, diyaframı iki parmağınız arasında gevşek bir şekilde tutun ve göğüs kafesini makasla kesin.
Diyaframı kaburgalara mümkün olduğunca yakın 360 derece kesin ve izole diyaframı bir Petri kabına yerleştirin. İzole edilmiş kasları kabaca bir milimetrelik parçalara ayırarak tek tek kıyın. Kıyılmış kasları beş litre ayrışma tamponu içeren 15 litrelik bir konik tüpe aktarın ve tüpü dakikada 60 dönüş hızında sallanan bir su banyosunda 35 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Kıyılmış kasların enzimatik sindiriminden sonra, süspansiyonu 15 mililitrelik tüpten 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. 20 gauge iğne ile donatılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak, numuneyi iğneden beş kez yukarı ve aşağı çekerek tekrar askıya alın. Hücre süspansiyonunu şırıngaya çekin ve numuneyi, üstüne bir hücre süzgeci takılı yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe süzün.
Tüm mono çekirdekli hücreleri almak için, boş konik tüpü 20 mililitre yıkama ortamı ile yıkayın ve gergin numune ile birleştirmek için süzgeçten dökün. Hücre süzgecinin altında kalan hacmi bir P1000 pipet ile alın. Doku ayrışması ve antikor boyamasını takiben, iskelet kası kök hücreleri veya MuSC'ler ve bireysel kaslardan fibro adipojenik progenitörler veya FAP'lar, floresan aktive hücre sıralama ile saflaştırıldı.
Hücreleri tanımlamak ve singlet'ları çiftlerden ayırmak için ilk geçitten sonra, boyama eşiklerini tanımlamak için FMO kontrolleri kullanılarak sonraki kapılar ayarlandı. Leke örneği kapılı olarak FAP'lara karşılık gelen SCA1 pozitif CD31 negatif ve CD45 negatif popülasyon ayrı bir toplama tüpüne ayrıldı. Çift negatif popülasyon, MuSC'lere karşılık gelen VCA pozitif popülasyonunu sıralamak için daha da geçitlendi.
Diyafram ve triseps kas tek hücreli süspansiyonları, diğerlerinden farklı olarak, FAP'lardan daha yüksek bir MuSC göreceli bolluğuna sahipti. EDU boyaması, sağlam olmasına rağmen, iki kök hücre tipi için ve farklı kaslar arasında EDU pozitif hücrelerin fraksiyonlarında bir fark olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, tüm dokular için, EDU pozitif MuSC'lerin ortalama fraksiyonu, EDU pozitif FAP'larınkinden daha yüksekti.
EDL ve GA'dan izole edilen MuSC'ler, TA, diyafram, gracilis veya trisepslere kıyasla anlamlı derecede daha düşük EDU katılımı göstermiştir. Benzer şekilde, EDU katılımında önemli farklılıklar farklı kaslardan izole edilen FAP'larda da gözlenmiştir. Son olarak, kök hücre izolasyon protokolünün özgüllüğünü gösteren immünofloresan boyama ile hücre saflığı doğrulandı.
En kritik adım, dokunun mekanik sindirimidir. Doku çok fazla kesildiğinde, canlılık azalır. Doku çok az kesildiğinde, EEL azalır.
Protokol, in vivo kök hücre fonksiyonlarını daha iyi anlamak için transplantasyon sonrası engraftman gibi hücre davranışını ölçen testlerle birleştirilebilir. Bu teknik, bireysel kaslardaki kök hücre davranışındaki farklılıkların, etkilenen kasların benzersiz kalıpları ile karakterize edilen hastalık fenotiplerine ve hastalıklarına katkıda bulunup bulunamayacağını cevaplayabilir.
