Bu protokol, viral vektörlerin doğrudan, pahalı özel ekipmanlara ihtiyaç duymadan çoğu laboratuvar ayarında kolayca uygulanabilen mısır tesislerine aşıılmasına izin verir. Doğrudan aşılama, alternatif bir konağın inoculum kaynağı olarak kullanımını ortadan kaldırarak hem zamandan hem de kaynaklardan tasarruf sağlar. Bu yöntem ek viral vektörlere, mısır hatlarına ve potansiyel olarak diğer monokot türlere uygulanabilir.
Tepsilerin içine yerleştirilen küçük kesici uçlarda turba bazlı yetiştirme ortamına 1 ila 2 mısır tohumu ekerek başlayın. Tepsileri 25 santigrat derecede 16 saatin altında bir büyüme odasına ve 22 ila 25 santigrat derecede 8 saat gece veya 16 saat gün ve 8 saat gece ile 22 ila 25 santigrat derecede bir seraya yerleştirin. Düzenli olarak bitkileri sulayın ve haftada bir kez milyon konsantrasyonda 330 parçada 15-5-15 sıvı gübre ile gübreleyin.
LB ortamlarında istenen viral yapıyı içeren agrobakteri suşunu antibiyotiklerle aşılayarak agrobakteriyi enjeksiyona hazırlayın. Ardından, 24 saat boyunca 225 RPM'de sallanırken şişeyi veya tüpleri 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4.000 kez G'de merkezileştirme ile bakterileri peletleyin ve süpernatant atın.
Daha sonra peleni bir mililitre deiyonize su ile yıkayın. Peletin 10 milimoler magnezyum sülfat çözeltisinin bir mililitresinde yeniden askıya alın ve optik yoğunluğu 600 nanometre olarak ölçün. Ardından 1.0 olarak ayarlayın.
Agrobakteri enjekte etmek için 4 ila 7 günlük mısır fideleri kullanın. Şırıngayı ve iğneyi birleştirin. Bakteri süspansiyonu, coleoptilüler düğümün 2-3 milimetre üzerine, coleoptile'ı doldurana veya bitkilerin büyüme aşamasında bekleyen whorl'da görünene kadar hafifçe enjekte edin.
Tüm fideleri enjekte edin ve her yapıyı enjekte etmek için şırıngayı ve iğneleri değiştirin. Kontrol genlerinin susturılmasından lezyonları gözlemleyerek fenotipik enfeksiyonu onaylayın, lezyon 22'yi taklit eder veya yapraklarda fitoen desaturaz. GFP ekspresyonunun varlığını tespit etmek için bitkilerin hızlı taranmasını ve floresan mikroskopisini görmek için floresan görüntüleme cihazı kullanın.
Enfeksiyonun moleküler tespiti için gen ekspresyon analizi yapın. Enfeksiyondan 14 ila 21 gün sonra enfekte bitkilerin yapraklarından toplam RNA çıkarın ve metin el yazmasında açıklandığı gibi ilk iplikçik cDNA'sını sentezleyin. Enfeksiyonu doğrulamak ve farklı viral yapılar için tasarlanmış belirli astarları kullanarak genin bütünlüğünü veya gen ilgisinin bir parçasını belirlemek için ters transkriptaz PCR gerçekleştirin.
Pcr ürününü, virüs ve gen veya gen parçasının varlığını veya yokluğunu belirlemek için nükleik asit lekesi içeren% 1 agarose jel üzerinde görselleştirin. Bu protokol, gen için tasarlanmış rekombinant virüsleri mısır fidelerine yerleştirmek için kullanıldı. Enjeksiyondan yaklaşık 12 gün sonra, yapraklarda nekroz ve fotobleaching olarak susturma fenotipleri gözlendi.
Enfeksiyon sonrası yapraklarda yapı varlığı, farklı bir GFP filtresi kullanılarak floresan altında yeşil floresan protein ekspresyonu gözlemlenerek tespit edildi. Foxtail mozaik virüs enfekte yapraklarda yeşil floresan protein ifadesi, yapraklara dağılmış küçük floresan delik alanları ve şeker kamışı mozaik virüsü enfekte yapraklarında büyük yamalar olarak görselleştirildi. Gen ekspresyon analizi kullanılarak sistemik foxtail mozaik virüs enfeksiyonu doğrulanmış ve fitoen desaturaz ve lezyon mimik 22'nin gen susturması veya baskılanması gözlenmiştir.
Yapı ayrıca enfeksiyon verimliliğini etkiledi. Foxtail mozaik virüs enfeksiyonu durumunda, foxtail mozaik virüs boş vektör ve foxtail mozaik virüs lezyonu 22 tipik olarak sırasıyla% 53 ve% 54 ile en yüksek enfeksiyon verimliliğine sahipti. Foxtail mozaik virüs fitoene desaturaz %39 ve foxtail mozaik virüs yeşil floresan protein, en düşük verimlilikte %16 ile bu arada şeker kamışı mozaik virüsü yeşil floresan proteininin enfeksiyon verimi %8 zamanlama ve semptomlar kullanılan viral vektör ve mısır hattına dayanacaktır.
Görsel fenotip eksikliği, susturma veya ifade eksikliği anlamına gelmeyebilir. Bu yöntem, kılavuz RNA'lar için teslimat yöntemlerini geliştirerek gen düzenleme teknolojilerine de uygulanabilir.
