Este protocolo permite la inoculación de vectores virales directamente en plantas de maíz que se pueden aplicar fácilmente en la mayoría de los entornos de laboratorio sin la necesidad de ningún equipo especializado costoso. La inoculación directa elimina el uso de un huésped alternativo como fuente de inóculo, ahorrando tiempo y recursos. Este método podría aplicarse a vectores virales adicionales, líneas de maíz y potencialmente otras especies de monocotiledóneas.
Comience plantando de 1 a 2 semillas de maíz en el medio de cultivo a base de turba en pequeños insertos colocados dentro de bandejas. Coloque las bandejas en una cámara de crecimiento de menos de 16 horas al día a 25 grados Celsius y 8 horas por noche a 22 a 25 grados Celsius, o en un invernadero a 22 a 25 grados Celsius con días de 16 horas y noches de 8 horas. Riegue regularmente las plantas y fertilize una vez a la semana con fertilizante líquido 15-5-15 a 330 partes por millón de concentración.
Prepare agrobacterium para inyección inoculando la cepa de agrobacterium que contiene la construcción viral deseada en medios LB con antibióticos. Luego, incube el matraz o los tubos a 28 grados centígrados mientras agita a 225 RPM durante 24 horas. Al día siguiente, peletizar la bacteria por centrificación a 4.000 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
Luego, lave el pellet con un mililitro de agua desionizada. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de solución de sulfato de magnesio de 10 milimolares y mida la densidad óptica a 600 nanómetros. Luego ajústelo a 1.0.
Use plántulas de maíz de 4 a 7 días de edad para inyectar agrobacterias. Ensamble la jeringa y la aguja. Inyecte suavemente la suspensión bacteriana 2-3 milímetros por encima del nódulo coleoptilular hasta que llene el coleoptilo, o sea visible en el verticilo, dependiendo de la etapa de crecimiento de las plantas.
Inyecte todas las plántulas y cambie la jeringa y las agujas para inyectar cada construcción. Confirmar la infección fenotípica mediante la observación de lesiones de silenciamiento de los genes de control, imitación de lesión 22 o fitoeno desaturasa en las hojas. Utilice un dispositivo de imágenes de fluorescencia para la detección rápida de plantas y microscopía de fluorescencia para detectar la presencia de expresión de GFP.
Realizar análisis de expresión génica para la detección molecular de la infección. Extraiga el ARN total de las hojas de las plantas infectadas de 14 a 21 días después de la infección, y sintetice la primera hebra de ADNc como se describe en el texto manuscrito. Realizar PCR con transcriptasa inversa para confirmar la infección y determinar la integridad del gen o fragmento de gen de interés utilizando cebadores específicos diseñados para diferentes construcciones virales.
Visualice el producto de PCR en un gel de agarosa al 1% que contiene una tinción de ácido nucleico para determinar la presencia o ausencia de virus y un gen o fragmento de gen. Este protocolo se utilizó para insertar virus recombinantes diseñados para el gen en las plántulas de maíz. Aproximadamente 12 días después de la inyección, se observaron fenotipos silenciadores en las hojas como necrosis y un fotoblanqueo.
La presencia de constructo en las hojas después de la infección se detectó mediante la observación de la expresión de proteínas fluorescentes verdes bajo una fluorescencia utilizando un filtro GFP diferente. La expresión de proteína verde fluorescente en hojas infectadas por el virus del mosaico de la cola de zorro se visualizó como pequeñas áreas punteadas de fluorescencia distribuidas a través de las hojas y como grandes parches en las hojas infectadas por el virus del mosaico de la caña de azúcar. Utilizando el análisis de expresión génica, se confirmó la infección sistémica por el virus del mosaico de la cola de zorro y se observó silenciamiento o supresión génica de la fitoeno desaturasa y la imitación de la lesión 22.
El constructo también utilizado influyó en la eficiencia de la infección. En el caso de la infección por el virus del mosaico de la cola de zorro, el vector vacío del virus del mosaico de la cola de zorro y la imitación del virus del mosaico de la cola de zorro 22 generalmente tuvieron las eficiencias de infección más altas con un 53% y un 54%, respectivamente. Virus del mosaico de la cola de zorro fitoeno desaturasa en una eficiencia ligeramente menor en un 39% y el virus del mosaico de la cola de zorro proteína fluorescente verde, en la eficiencia más baja en el 16%Mientras tanto, la eficiencia de infección de la proteína fluorescente verde del virus del mosaico de la caña de azúcar fue del 8% El momento y los síntomas se basarán en el vector viral y la línea de maíz utilizada.
La falta de un fenotipo visual puede no significar una falta de silenciamiento o expresión. Este método también se puede aplicar a las tecnologías de edición de genes mejorando los métodos de entrega de ARN guía.
