Этот протокол позволяет прививать вирусные векторы непосредственно в растения кукурузы, которые могут быть легко применены в большинстве лабораторных условий без необходимости использования какого-либо дорогостоящего специализированного оборудования. Прямая инокуляция исключает использование альтернативного хозяина в качестве источника инокулята, экономя как время, так и ресурсы. Этот метод может быть применен к дополнительным вирусным векторам, линиям кукурузы и, возможно, другим однодольным видам.
Начните с посадки 1-2 семян кукурузы в питательную среду на торфяной основе в небольшие вставки, размещенные внутри лотков. Поместите лотки в камеру роста под 16-часовыми днями при 25 градусах Цельсия и 8-часовыми ночами при 22-25 градусах Цельсия или в теплице при 22-25 градусах Цельсия с 16-часовыми днями и 8-часовыми ночами. Регулярно поливайте растения и удобряйте раз в неделю 15-5-15 жидкими удобрениями в концентрации 330 частей на миллион.
Подготовьте агробактерию к инъекции, привив антибиотиками штамм агробактерии, содержащий нужную вирусную конструкцию, в ЛБ-среде. Затем высиживают колбу или трубки при 28 градусах Цельсия при встряхивании при 225 об/мин в течение 24 часов. На следующий день гранулируют бактерии путем центрификации в 4000 раз г в течение 10 минут при комнатной температуре и выбрасывают супернатант.
Затем промыть гранулу одним миллилитром деионизированной воды. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре 10-миллиметрового раствора сульфата магния и измерьте оптическую плотность на 600 нанометрах. Затем отрегулируйте его до 1.0.
Используйте саженцы кукурузы возрастом от 4 до 7 дней для инъекции агробактерий. Соберите шприц и иглу. Осторожно вводят бактериальную суспензию на 2-3 миллиметра выше колеоптикулярного узла, пока она не заполнит колеоптиль или не будет видна в мутовке, ожидая на стадии роста растений.
Введите все саженцы и замените шприц и иглы для инъекции каждой конструкции. Подтвердить фенотипическую инфекцию, наблюдая поражения от глушения контрольных генов, имитирующих поражение 22 или фитоендесатуразы на листьях. Используйте устройство флуоресцентной визуализации для быстрого скрининга растений и флуоресцентную микроскопию для обнаружения присутствия экспрессии GFP.
Выполните анализ экспрессии генов для молекулярного обнаружения инфекции. Извлекают общую РНК из листьев зараженных растений через 14-21 день после заражения и синтезируют первую цепь кДНК, как описано в тексте рукописи. Выполните ПЦР с обратной транскриптазой для подтверждения инфекции и определения целостности гена или интересующего фрагмента гена с использованием специфических праймеров, предназначенных для различных вирусных конструкций.
Визуализируйте продукт ПЦР на 1% агарозном геле, содержащем пятно нуклеиновой кислоты, чтобы определить наличие или отсутствие вируса и гена или фрагмента гена. Этот протокол использовался для вставки рекомбинантных вирусов, спроектированных для гена, в саженцы кукурузы. Примерно через 12 дней после инъекции на листьях наблюдались фенотипы глушения в виде некроза и фотоотбеливания.
Наличие конструкции в листьях после заражения было обнаружено путем наблюдения экспрессии зеленого флуоресцентного белка под флуоресценцией с использованием другого фильтра GFP. Экспрессия зеленого флуоресцентного белка в зараженных вирусом лисохвостах листьев была визуализирована как небольшие пунктатные участки флуоресценции, распределенные по листьям, и как большие пятна в зараженных вирусом мозаики сахарного тростника листьях. С помощью анализа экспрессии генов была подтверждена системная инфекция вируса мозаики лисохвоста и наблюдалось глушение генов или подавление фитоендесатуразы и имитации поражения 22.
Используемая конструкция также повлияла на эффективность инфекции. В случае заражения вирусом мозаики лисохвоста пустой вектор вируса мозаики лисохвоста и поражения вирусом мозаики лисохвоста 22 обычно имели самую высокую эффективность заражения - 53% и 54% соответственно. Вирус мозаики foxtail phytoene desaturase при несколько более низкой эффективности на 39% и вирус мозаики foxtail зеленый флуоресцентный белок, при самой низкой эффективности в 16% Между тем, эффективность заражения вирусом мозаики сахарного тростника зеленого флуоресцентного белка составила 8% Сроки и симптомы будут основаны на вирусном векторе и используемой линии кукурузы.
Отсутствие визуального фенотипа не может означать отсутствие глушения или экспрессии. Этот метод также может быть применен к технологиям редактирования генов путем улучшения методов доставки направляющих РНК.
