このプロトコルにより、ウイルスベクターをトウモロコシ植物に直接接種することができ、高価な特殊機器を必要とせずに、ほとんどのラボ環境で容易に適用できます。直接接種により、接種源としての代替宿主の使用がなくなり、時間とリソースの両方を節約できます。この方法は、追加のウイルスベクター、トウモロコシ系統、および潜在的に他の単子葉植物種に適用することができる。
まず、トレイの内側に置かれた小さなインサートに泥炭ベースの栽培培地に1〜2個のトウモロコシの種を植えることから始めます。トレイを摂氏25度で16時間、夜22〜25度で8時間、または摂氏22〜25度の温室に16時間、夜8時間置きます。定期的に植物に水をやり、週に1回、15-5-15の液体肥料を330ppmの濃度で施肥します。
LB培地中の所望のウイルス構築物を含むアグロバクテリウム株に抗生物質を接種することによって注射用アグロバクテリウムを調製する。次いで、フラスコまたはチューブを摂氏28度で225RPMで24時間振とうしながらインキュベートする。翌日、室温で10分間4,000倍Gで遠心分離することにより菌をペレット化し、上清を捨てた。
その後、ペレットを1ミリリットルの脱イオン水で洗浄する。ペレットを1ミリリットルの10ミリモル硫酸マグネシウム溶液に再懸濁し、600ナノメートルでの光学密度を測定した。次に、1.0に調整します。
アグロバクテリウムを注入するために4〜7日齢のトウモロコシの苗木を使用してください。シリンジと針を組み立てます。細菌懸濁液を、骨瞼下垂体がいっぱいになるまで、または植物の成長段階に保留中、渦巻きに見えるまで、鞘窩結節の2〜3ミリメートル上に静かに注入する。
すべての苗を注入し、各構築物を注入するための注射器と針を交換する。対照遺伝子をサイレンシングすることから病変を観察し、葉の上の病変22またはフィトエンデサチュラーゼを模倣することによって表現型感染を確認する。植物の迅速なスクリーニングのための蛍光イメージング装置およびGFP発現の存在を検出するための蛍光顕微鏡法を使用する。
感染の分子検出のための遺伝子発現解析を行う。感染後14~21日目に感染植物の葉から全RNAを抽出し、本文原稿に記載のようにして第1鎖cDNAを合成した。逆転写酵素PCRを実行して感染を確認し、異なるウイルス構築物用に設計された特異的プライマーを使用して、目的の遺伝子の完全性または遺伝子断片を決定します。
核酸染色を含む1%アガロースゲル上のPCR産物を視覚化し、ウイルスおよび遺伝子または遺伝子断片の有無を判定する。このプロトコルは、遺伝子用に操作された組換えウイルスをトウモロコシの苗木に挿入するために使用された。注射後約12日目に、消失および光退色として葉にサイレンシング表現型が観察された。
感染後の葉における構築物の存在は、別のGFPフィルターを用いて蛍光下での緑色蛍光タンパク質発現を観察することにより検出した。フォックステールモザイクウイルス感染葉における緑色蛍光タンパク質発現は、葉全体に分布する蛍光の小さな点状領域およびサトウキビモザイクウイルス感染葉における大きなパッチとして視覚化された。遺伝子発現解析を用いて、全身性フォックステールモザイクウイルス感染が確認され、フィトエンデサチュラーゼ及び病変模倣体22の遺伝子サイレンシング又は抑制が認められた。
このコンストラクトはまた、感染効率に影響を与えて使用された。フォックステールモザイクウイルス感染の場合、フォックステールモザイクウイルス空ベクター、およびフォックステールモザイクウイルス病変模倣体22は、典型的には、それぞれ53%および54%で最も高い感染効率を有した。フォックステールモザイクウイルスフィトエンデサチュラーゼは39%でわずかに低い効率で、フォックステールモザイクウイルス緑色蛍光タンパク質は、16%で最も低い効率で、一方、サトウキビモザイクウイルス緑色蛍光タンパク質の感染効率は8%であったタイミングおよび症状は、使用したウイルスベクターおよびトウモロコシ系統に基づくであろう。
視覚的表現型の欠如は、サイレンシングまたは表現の欠如を意味しないかもしれない。この方法は、ガイドRNAの送達方法を改善することにより、遺伝子編集技術にも応用することができる。
