Bu çalışma, gaz pompası kolları, oyun alanları ve ATM'ler gibi kentsel ortamda nadiren temizlenen yüzeylerde SARS-CoV-2'yi tespit etmek için yeni bir iş akışı sunmaktadır. Bir pandemide, erzak kıtlığı vardır. Temel laboratuvar ortamlarında bulunan kolayca elde edilebilen malzemeler, reaktifler ve ekipmanlar kullanıyoruz.
Soğuk zincir olmadan RNA'yı koruyan bir ekstraksiyon yöntemi ve inhibitörlere dayanıklı bir algılama yöntemi kullanıyoruz. Bu protokol kamu sağlığını ilgilendiriyor. Gelecekteki küresel salgınlar sırasında mevcut COVID-19 salgını ve diğer bulaşıcı ajanlar için çevresel viral rezervuarların değerlendirilmesi için bir çerçeve sağlar.
Yerel ve sosyal medya aracılığıyla yayınlanan doğrudan ve net bir eylem çağrısı kullanarak vatandaş bilim adamlarını işe alın. Konuyu sosyal medya içeriğine bağlamak için bir sosyal medya tanıtıcısı oluşturun. Çevrimiçi bir formda belirtilen biyogüvenlik ile ilgili soruları yanıtlayarak bireylerin çevresel örnekleme çabalarına katılmak için başvurmaları için birden fazla dilde gezinmeyi sağlamak için çok dilli bir eklenti sağlayarak SMP'ye bir bağlantı oluşturun.
örnekleme bölümüne İngilizce ve İspanyolca grafik ve görsel-işitsel protokolleri ekleyin. Bir bulut bilgisayar hizmeti sağlayıcısı tarafından kolaylaştırılan jeo uzamsal uygulama programlama arabirimini kullanarak jeo uzamsal verileri görselleştirin. Merkezi depolamayı, işleme iş akışlarının izlenmesini ve lojistiğin yönetimini kolaylaştırmak için SMP aracılığıyla LIMS'ye gönderilen verileri depolayın.
Veri türü uyumluluğunu etkinleştirmek ve hatayı en aza indirmek için örnek kit kimliği, örnek kimliği, tarih, saat ve genel konumlandırma sistemi koordinatları gibi ön yükleme bilgileri. Katılımcılar için, tüm örnekleri topladıktan sonra kullanabilecekleri bir örnek teslim alma isteği bağlantısı ekleyin. Maske ve eldiven, numune alma protokolü ve biyogüvenlik ile ilgili bilgiler gibi gerekli kişisel koruyucu ekipman da dahil olmak üzere tüm örnekleme malzemelerini içeren bir kit oluşturun.
Bir santimetrekare polyester emici bezeyi deterjanla ıslatarak ve 10 santimetrekarelik bir yüzeyi temizleyerek evlerde ve kentsel çevrede yüzeyleri nadiren dezenfekte etti. Bir kürdan yardımıyla, her örnek çubuğu 200 mikrolitre guanidinium tiyosiyanat içeren önceden etiketlenmiş tüpe batırın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her numunenin toplanması için sağlanan maskeyi ve yeni bir çift eldiven takın.
Örneklemesi bitirdikten sonra, sağlanan el dezenfektanını kullanın. Tüpleri laboratuvara taşınana kadar dört santigrat derecede saklayın. Numuneler laboratuvara ulaştığında eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Taramanın hızını artırmak için örnekleri havuzlarda işleyin. Havuz pozitifse, her örneğin RNA'sını bağımsız olarak ayıklayın. Sekiz numunenin her birinin 50 mikrolitresini bir mikrosantrifüj tüpüne bir araya getirerek ve kalan örnekleri eksi 80 santigrat derecede kurtararak her örnekleme kitinden alınan örnekleri iki havuzda birleştirin.
15 saniye boyunca 80 mikrolitre kloroform ve girdap ekleyin. Sonra dört santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yaslanın. 13,000 kez G'de 20 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj.
Sulu tabakayı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Kalan arayüzü ve pembe sıvıyı eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın. Bu fraksiyonlar DNA ve protein içerir.
Guanidinium tiyosiyanat bazlı RNA ham ekstraksiyon protokolü kullanarak kurtarılan sulu tabakadan RNA çıkarın. Borulama kaybını hesaba katmak için ODA SıCAKLıĞıNDA %10 fazla hacimde RT-LAMP reaksiyon karışımını hazırlayın. Numune reaksiyona beş mikrolitre RNA ve beş mikrolitre RNA artı çivili reaksiyona 2,5 mikrolitre sentetik SARS-CoV-2 RNA ekleyin.
Pozitif kontrole 2,5 mikrolitre sentetik SARS-CoV-2 RNA ve negatif kontrole beş mikrolitre su ekleyin. İyice karıştırın ve reaksiyonları kısın. Kolorimetrik gözlem için negatif bir sonuç pembe, pozitif sonuç ise sarı ile gösterilir.
RT-LAMP'den sonra jel elektroforez gerçekleştirin. Örnek toplama sitelerinin dağılımı burada gösterilmiştir. Kitlerin çoğunluğu tamamlandı ve ilgili veriler LIMS'ye yüklendi.
%100 frekansta algılama sınırı 25 mikrolitre reaksiyon başına 500 kopya idi. Kolorimetrik RT-LAMP'de pozitif örnekler, pH kayması nedeniyle pembeden sarıya renk değiştirdi. Düşük kopya numaralarında, numuneler, ortaya çıkan merdiven benzeri desenle pozitifleri doğrulamak için bir agarose jel üzerinde çalıştırıldı.
RT QPCR yöntemleri çevresel örneklerle test edilmiştir. Tüm ana karışımlar, pozitif kontrolün düşük kopya sayısı konsantrasyonlarında inhibitörlere karşı hassastı. Şablonun düşük konsantrasyonlarında, geleneksel RT PCR yöntemleri yanlış pozitifler ve yanlış negatifler gösterdi.
Son olarak, yuvarlanan daire amplifikasyonu adı verilen bir teknik, hedef sıranın küçük miktarlarını tespit etti. Bununla birlikte, bir RNA şablonunun yokluğunda probun amplifikasyonu gösterdi. Toplumun tüm sektörlerine ulaşan bir eylem çağrısı yayınlamak çok önemlidir, bu nedenle örnekleme gerçekten bu topluluğun tüm üyelerinin maruz kalma riskini temsil eder.
Bu çerçeve SARS-CoV-2 genetik materyali tespit eder. Viral canlılığı test etmek için yapılan çalışmalar bir sonraki adımdır.
