Hastalık modelleme için insan 3D akciğer doku kültürleri (3D-LTCs) nesil

Bu yöntem, canlı insan dokusunun doğal 3Boyutlu yapısında ve bileşiminde, temel laboratuvar bulgularının potansiyel tedavilere çevrilmesine olanak sağlar. Bu teknik özellikle cerrahi olarak rezeke veya bireysel ölen hasta akciğer dokusu örneklerinin görselleştirilmesi için insan akciğer dokusu ekstrektidoku kültürleri nesil sağlar. Hastalıksız akciğer dokusu, yüksek spatiotemporal çözünürlükte erken patomekanizmaların analizini sağlayan akciğer hastalıkları ex vivo modellenmesi nde 3D doku kültürleri olarak kullanılabilir.

Rezeke akciğer örneğini steril 15 santimetrelik kültür çanağı ve steril metal tepsiye 15 mililitrelik bir tarım ortamına yerleştirerek başlayın ve 30 mililitrelik şırıngayı 42 derece düşük erime noktası agarose ile doldurun. Obturator'u periferik venöz kateterden çıkarın ve kateteri 30 mililitreşşile takın. Doku bozulmamış bir bölümünde ventilat doku da 0,5 ila 3 milimetre çapında bronş tanımlayın ve yavaşça bronş içine mümkün olduğunca kanula takın.

Kanula etrafında bronşiyol duvarı sıkıştırmak için forceps kullanın, ideal aynı anda herhangi bir komşu pulmoner arter kenetleme, kanula etrafında bronş mühür ve diğer ek hava yollarını tıkamak için cerrahi bir kelepçe kullanmak, agarose sızıntısını önlemek için. Daha sonra, kültür çanak akciğer dokusunu kaldırmak için forseps kullanın, ve el ile kanula yoluyla agarose teslim etmek için şırınga kullanın, saniyede 0.3 mililitre daha hızlı. Akciğer dokusu tamamen doku şişirme olmadan doldurulduğunda, hemen kanula kaldırmak ve bronş kelepçe.

Agarose katılaşmasını kolaylaştırmak için 4 derece lik kültür ortamına dokuyu 30 dakika batırın ve ek bronşiyol açıklıkları için agarose dolum işlemini tekrarlayın. Daha sonra, agarose dolu akciğer dokusu bölümlerini dilimleyene kadar dört derece lik bir ortamda saklayın. Hassas kesilmiş akciğer dilimleme için, akciğer dokusu içinde katı agarose dolu bölgeleri belirlemek, yavaşça hücre kültür çanak altına karşı cımbız ile basıldığında çökmez.

Bir tarafı hala plevra ile kaplı katı dolu bölgenin 1 ila 1,5 santimetreküplük blok excise ve vibratom tutucu için her doku bloğunun çoğul tarafı eklemek için siyanoakrilat tutkal kullanın. Dilim uzun doku bloğu boyunca, doku sadece 2-3 milometers dilimlenmemiş kalana kadar. Her 500 mikrometre lik kesiti, elde edildikleri gibi, ekim ortamı içeren on iki kuyuluk bir plakanın bir kuyuya aktarmak için çereksiler kullanmak.

Tüm doku kesitli olduğunda, her kuyudan alınan örnekleri tek tek on santimetrelik kültür yemeklerine aktarın ve dört milimetrelik biyopsi zımbalayıcıyı ortogonal olarak hassas kesilmiş akciğer diliminin üst yüzeyine yerleştirin. Daha sonra, saat yönünde ve saat yönünün tersine dönmelerde zımba hareket, akciğer örneğindoku yumrukları elde. Her yumruğu taze hücre kültürü ortamına yerleştirerek 96 kuyuluk tabakta ayrı ayrı kuyular elde edilir.

Tüm doku yumrukları elde edildiğinde, beş güne kadar hücre kültürü kuluçka makinesinde plaka yerleştirin. İnsan 3-B akciğer dokusu kültürlerinde İmmünfluoresans kullanılarak hücre çekirdeğinde fibronektin immünetiketleme korunmuş alveoler yapı ex vivo görüntüleme sağlar. İnsan hassas kesilmiş akciğer dilimi punches tedavisi 48 saat boyunca bir profibrotik sitokin kokteyl ibret ile insan akciğer 3-D doku kültürlerinde fibrozis benzeri değişiklikler sonuçları, fibrozis ilgili ekstrasellüler matris bileşenlerinin önemli indüksiyon dahil, kollajen Tip Bir, ve fibronektin genleri.

Ayrıca, mezenkimal marker vimentin protein düzeyleri kadar 3-D akciğer dokusu kültürü yumruklar tedavisinden sonra dört hastadan üç düzenlenir. Bu prosedürü takiben, kantitatif gerçek zamanlı PCR ile RNA analizi veya batı blotting protein analizi gibi diğer yöntemler, doku içinde sırasıyla gen ve protein ekspresyonunu değerlendirmek için yapılabilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra deneysel pulmonoloji alanında araştırmaların, akciğer biyolojisinin eksektir ve insan doku örneklerinde toksikolojik ve farmakolojik çalışmalar yapmanın önünü açmıştır.

Canlı insan dokusunun potansiyel olarak enfektif olduğunu ve kişisel koruyucu ekipman ve uygun doku depolama, taşıma ve atık işleme gibi ihtiyati önlemlerin bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınması gerektiğini unutmayın