FFPE'den veya taze dondurulmuş malzemeden küçük dağınık bölgelerin izolasyonu veya zenginleştirilmesi, otomatik diseksiyon ile geleneksel yöntemlerden daha hızlı ve verimli bir şekilde sağlanabilir. FFPE'den veya taze dondurulmuş dokudan genomik materyalin çıkarılması, birçok klinik ve translasyonel araştırma laboratuvarı için bir gerekliliktir. Otomatik diseksiyon, makro diseksiyon ve lazer yakalama mikro diseksiyonu arasındaki önemli bir boşluğu doldurur.
Başlamak için, satıcı tarafından sağlanan bir görüntüleme platformu veya açık kaynaklı bir görüntüleyici kullanarak taranan slayt görüntülerine ilgilenilen tümör bölgeleri için açıklama ekleyin. Dijital slayt referansı kullanırken lekesiz numune dokusu slaytını birinci ila dördüncü slayt konumunda sahneye yerleştirin. İş listesi'ni açarak otomatik doku diseksiyonu yazılımını kullanarak bir frezeleme işi oluşturun, ardından Yeni iş oluştur'u seçin ve işin adını girmek için servis talebi kimliğini ve adını girin.
Kalınlık'a gidin ve yukarı veya aşağı ok sekmesini kullanarak bölüm kalınlığını seçin. Ardından, Doku hazırlama'ya gidin ve Parafinize veya Deparafinize seçeneğini belirleyin. Referans görüntü"Dosyadan" seçeneğini belirleyin ve Görüntüyü içe aktar'ı seçin.
Ardından, açılır menüden içe aktarılacak dosyayı dijital başvuru olarak seçin. Her örnek doku slaytını birinci ila dördüncü konumda yakalamak için sağ alt köşedeki "Tarama aşaması" düğmesini seçerek aşamayı tarayın. Sahne alanında başvuru için, doku üzerinde dikdörtgen bir alan oluşturmak üzere kutuyu sürükleyin ve sahne alanı referans görüntüsünü yakalamak için dikdörtgen alanın altındaki dairesel kabarcığı seçin.
Bu dikdörtgen alanı, referans görüntünün sağ üst köşesindeki kopyala seçeneğini belirleyerek ikinci ila dördüncü slayt konumlarında kalan örnek doku slaytlarına kopyalayın. Ardından, gerektiği gibi hizalayın ve yeniden boyutlandırın. Dijital referans görüntüsü için, görüntüyü seçilen dikdörtgen alanın üzerine yerleştirin.
Ardından, dijital referansı büyük ölçüde yeniden boyutlandırın ve hizalayın, tabii ki yakınlaştırın, böylece boyut ve numune dokusu üzerindeki konumla en iyi şekilde eşleşin. Bu dikdörtgen alanı, referans görüntünün sağ üst köşesindeki kopyala seçeneğini belirleyerek ikinci ila dördüncü slayt konumlarında kalan örnek doku slaytlarına kopyalayın. Ardından, gerektiği gibi hizalayın ve yeniden boyutlandırın.
İnce ayar adımına geçmek için sağ alt köşedeki "Tarama aşaması" düğmesini seçin. Örnek slayt kaplamasıyla en iyi şekilde eşleşecek şekilde referansın ince hizalamasını ve yakınlaştırma ayarlarını yapmak için ilk aşama konumunu ve sağ araç çubuğundaki Dönüştürme aracı simgesini seçin. Referans ve örnek görüntüler arasında geçiş yaparak ekranın altındaki kayar çubuğu örneklemek için referansı kullanın.
Ayrıca, her slayt konumunun hizalamasını ayarlamak ve elde etmek için yakınlaştırma ve uzaklaştırma özelliği. En uygun numune kaplaması elde edildikten sonra, sağ araç çubuğundaki renk seçici takım simgesini seçerek maskelenmiş referans görüntüsünün renkli kısmına frezeleme yolu atamalarını çizin. Ekranın sağ alt köşesindeki Ek açıklamaları al" düğmesini seçerek frezeleme yollarını örnek slaytların üzerine çizin.
Frezeleme yolu hesaplanırken açıklamalı ilgili bölgeyi dört veya daha az frezeleme ucuyla yakalayın ve toplayın. Sol üst köşedeki frezeleme ucu kullanımı, kaplanan alana ve seçilen uç boyutuna göre hesaplanır. Uç boyutu frezeleme ucu oku altında değiştirilebilir ve uç kullanımı yeniden hesaplanır.
Frezeleme yolu ilk kızak konumunda seçildiğinde, kalan kızak konumlarına kopyalanır. Frezeleme uçlarının toplama borularından sahnede doğru şekilde atanmış şekilde hızlı bir şekilde yüklenmesi için ekranın sağ alt köşesindeki Kurulum aşaması" düğmesini seçin. Rezervuarı, doku tipi ve aşağı akış nükleik asit ekstraksiyonu için üç mililitre uygun diseksiyon tamponu ile doldurun.
Ardından, ekranın sağ alt köşesindeki "Dissect" düğmesini seçin. Otomatik diseksiyondan sonra, toplama tüplerini ve disseke edilmiş numune slaytlarını sahneden çıkarın. Toplama tüplerini tüp rafına, kızakları da sürgü rafına yerleştirin.
H&E boyalı formalin, sabit parafin gömülü ve ksenogreftlerde metastatik kolorektal kanser içeren taze dondurulmuş fare karaciğeri bölümleri, 20x büyütmede bütün bir slayt görüntüleyicide tarandı ve referans slaytlar olarak kullanıldı. H&E boyalı referans slaytlarına diseksiyon ve nükleik asit ekstraksiyonu için tümör bölgeleri için açıklama eklendi ve dijital olarak maskelendi. Diseksiyon sonrası numune slaytları, diseksiyon alanlarını 10 mikrometre ve 20 mikrometre slaytlarında doğrulamak için H & E boyandı.
Yakalanan metrikler, otomatik diseksiyon ve nükleik asit ekstraksiyonunun başarısını göstermiştir. Bu protokolü denerken, lekesiz slaytlara nispeten doğru bir ek açıklama bindirmesi elde etmenin ilgi alanlarını yalıtmak için önemli olduğunu unutmayın.
