Bu protokol, yerli megakaryositlerin kemik iliğinde maruz kaldıkları hapsetme ve orta sertliğin davranışları ve olgunlaşmaları üzerindeki etkisinin in vitro olarak değerlendirilmesini sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, hücre-hücre ve hücre matrisi etkileşimlerini ortadan kaldıran ve mekanik yönlere odaklanan basitleştirilmiş bir modeldir. İyi laboratuvar uygulamalarına ve steril çalışma koşullarına kesinlikle uyulmalıdır.
Aslında, hidrojel'in hafif bir kirlenmesi bile megakaryosit farklılaşması üzerinde dramatik bir etkiye sahip olabilir. Tek bir hidrojel hücre kültürü kuyusu elde etmek için, oda sıcaklığında% 3 metilselülozun iki mililitrelik aliquots'unu çözerek başlayın, ardından önce bir mililitre çizerek ve sonra hepsini dışarı atarak bir mililitre Luer kilit şırındını metilselülozla kaplayın. Daha sonra, aynı şırınga ve iğneyi kullanarak, taze bir aliquot'tan 333 mikrolitre metilselüloz çizin.
İğneyi dikkatlice çıkardıktan sonra, bir Luer kilit konektörünü şırınganın ucuna vidalamak için sterilize edilmiş önlük kullanın, ardından konektöre ikinci bir kaplamasız bir mililitre Luer kilit şırıngası takın. Metilselülozu iki şırınna eşit olarak dağıtın ve bir kenara koyun. Daha sonra, konsantre kültür ortamında daha önce izole edilmiş fare soyu negatif hematopoetik kök ve progenitör hücreleri 167 mikrolitre başına altı hücreye bir kez 10 yoğunlukta yeniden kullanın.
Şırıngalardan birini konektörden çıkarın ve hücre süspansiyonunun 167 mikrolitresini doğrudan konektöre takın ve aynı anda şırınga pistonu yavaşça çekerek hücre süspansiyonuna yer açın. Tüm hücre süspansiyonu konektöre ekledikten sonra, süspansiyonu konektörden çekmek için pistonu daha fazla çekin ve vida ipliğinde herhangi bir süspansiyon kaybetmemeye dikkat ederek ikinci şırınna dikkatlice yeniden bağlayın. Metilselüloz ortamını hücre süspansiyonu ile homojen hale getirmek için pistonları iki şırınna arasında 10 kez yavaşça ileri geri hareket ettirin, ardından toplam hacmi bir şırınna çekin ve iki şırınnayı çıkarın, konektörü boş olanda bırakın.
Şırınnanın içeriğini dört kuyulu bir plakanın bir kuyusuna boşaltın ve plakayı% 5 karbondioksitin altında 37 derecede kuluçkaya yatırın. Proplateletleri analiz etmek için, kültürün üçüncü gününde, tüm hücreleri bir kuyudan% 1 PSG ile 10 mililitre DMEM içeren 15 mililitrelik bir tüpe dikkatlice aktarın. Metilselülozu tamamen seyreltmek için hafifçe pipetleme yaparak hücreleri yeniden depolayın, ardından oda sıcaklığında 300 kat G'de tüpü beş dakika santrifüjleyin.
Süpernatantı attıktan sonra, hücre peletini bir mililitre tam kültür ortamında yeniden depolayın ve hücreleri dört kuyulu bir plakanın kuyusu başına 500 mikrolitrede yeniden tohumlayın. Plakayı %5 karbondioksitin altında 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Ertesi gün, 20X hedefi olan bir Brightfield mikroskobu kullanarak, görüş alanında çok fazla hücre olmadığından emin olarak ve alan başına en az beş megakaryosit yakalayarak, kuyu başına rastgele 10 görüntü elde edin.
ImageJ kullanarak, proplatletleri genişleten megakaryositlerin oranını hesaplamak için her görüntüdeki toplam megakaryosit sayısını ve proplateletleri genişletenleri sayın. Hücreleri gelecekteki analizler için sabitlemek için, jeli bozmadan metilselülozun üzerine fiksatif çözeltiyi ekleyin. Kullanılan fiksatife bağlı olarak uygun bir süre bekledikten sonra, metilselüloz homojen bir şekilde seyreltilene kadar fiksatif ve jel boruyu hafifçe pipetlemek için bir P1000 pipet kullanın.
Ve aynı pipet ucunu kullanarak, kuyunun tüm içeriğini 10 mililitre DPBS içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve karıştırarak homojenize edin. Karışımı santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve megakaryosit peletini istenen analize uygun bir ortamda yeniden atın.
Kültürün üçüncü gününe kadar, sıvı ortamdaki megakaryositler kuyunun dibinde tortulaşmıştır ve sert plastik yüzeyin yanı sıra diğer hücrelerle de temas halindedir. Buna karşılık, metilselüloz hidrojel içine gömülü hücreler homojen bir şekilde dağıtılır ve komşu hücrelerden izole edilir. Farklı kültür koşullarında megakaryositlerin ortalama çapının analizi, %2 metilselülozun sıvı kültürüne göre ortalama megakaryosit çapını biraz artırdığını göstermektedir.
Bununla birlikte, metilselüloz konsantrasyonunun% 0,5 oranında artırılması, daha küçük bir ortalama çapla belirtildiği gibi megakaryosit farklılaşmasına zarar verir. Temsili iletim elektron mikroskopi görüntülerinde, kemik iliği içinde in vivo olarak farklılaşmış megakaryositlerdeki intrasitoplazmik membranlar, tanımlı sitoplazmik bölgelerle yakından karşıt görünmektedir. Sıvı kültüründe, zarlar çoğunlukla sitoplazmik bölgelerin sınırlandırılmamış küçük yuvarlak oval görünümüne veya uzun veziküllerine sahiptir.
Buna karşılık, %2 metilselüloz kültürü, yerinde yapıya benzeyen sitoplazmik bölgeleri sınırlayan membranlara yakından karşı çıkmıştır. Kültürün dördüncü gününe gelindiğinde, daha önce hidrojelde kültürlenen megakaryositler, sıvı ortamda kültürlenenlere kıyasla proplatlet oluşumunun arttığını göstermektedir. Megakaryosit uzatma proplateletlerinin ortalama oranı genellikle sıvı bir ön kültür ile% 15 ila 20 civarındadır, metilselüloz hidrojel pre-kültürü ile% 35 ila 40'a kıyasla.
Bu prosedürü denerken, son metilselüloz konsantrasyonundaki küçük bir değişiklik ortam sertliğini önemli ölçüde değiştirebileceği için uygun hacimleri çok hassas bir şekilde pipetlemek önemlidir. Hidrojeldeki hücre olgunlaşmasını takiben, megakaryositler akış sitometrisi ile ploidy ve hücre belirteci analizi için geri kazanılabilir veya elektron mikroskopisi veya ilgi çekici proteinin immünostainasyonu için sabitlenebilir.
