The work was supported by grants from the Universit&#233; catholique de Louvain (Action de recherch&#233; concert&#233;es) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from T&#233;l&#233;vie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation &#224; la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).

Fareler Üniversitesi Hayvan Refahı Komitesi laboratuvar hayvan bakım ilkelerine göre kaldırdı ve tedavi edildi. Tüm prosedürler ve protokoller bu Komitesi tarafından kabul edildi. 1.. Mikroskopi Plastik Kültür Odaları Kaplama Not: bir laminar akış başlığı içinde steril koşullar altında, aşağıdaki tüm adımları uygulayın. Kaplamanın iki tür işlevsel olarak eşdeğerdir. <ol><li> Fibronektin önce tiroid dokuların izolasyonu için bir gün ile kaplayın plastik kültür odaları: <ol><li> 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 0.25 ug / ml fungizon ve 2 mM glutamin, 12 ile takviye edilmiş M199 ortamı içinde bir 50 ug / ml nihai konsantrasyona kadar steril fibronektinin seyreltin. </li><li> Seyreltilmiş fibronektinin 200 ul ile kuyu kapağı ve 4 ° C gece boyunca buzdolabında inkübe edin. </li><li> Diseksiyon gününde, M1 ile bir kez kuyu durulayın, fibronektin aspire99 ve antibiyotik, glutamin ve% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş M199 200 ul minimum hacim eklemek. </li><li> Eksplantlar plaka hazır kadar inkübatör kaplı odaları bırakın. </li></ol></li><li> Türü ile kaplayın plastik kültür odaları Ben tiroid dokularında izolasyonu 2 saat önce kollajen: <ol><li> I 10 mM HCI içinde 50 ug / ml nihai konsantrasyona kadar steril kollajen tipi seyreltin. NOT: buz üzerinde kollajen stok çözüm tutun. </li><li> Tip I kollajenin seyreltilmiş 200 ul ile kuyu örtün ve oda sıcaklığında (RT), 2 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> I çözeltisi kollajen tipi aspire, M199 ile bir kez durulama kuyu ve antibiyotik, glutamin ve% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş M199 200 ul minimum hacim eklemek. </li><li> Eksplantlar plaka hazır kadar inkübatör kaplı odaları bırakın. </li></ol></li></ol> Tiroid Anlagen içeren Dokular 2. Diseksiyonu (E12.5) veya tiroid lobları (E13.5-e14.5) NOT: temiz kesme aletleri ve Petri / kültür plakaları kullanın. Aşağıda tarif edilen genel adımlar ve insizyon E12.5 ve E14.5 embriyolar için aynıdır. <ol><li> İstenilen embriyonik (E12.5 itibaren E14.5 için) (e) günlük zaman aşımına gebe dişi fareler Kurban ve diseksiyon aletleri kullanarak rahim kaldırmak. </li><li> HBSS içeren bir 10 sm&#39;lik plaka içinde parçalara rahim yerleştirin. </li><li> Forseps ile rahim bir ekstremite tutun ve giderek tüm embriyolar kurtarmak için küçük bir makas ile rahim açın. </li><li> Makas ile plasenta embriyoların ayırın ve HBSS içeren yeni bir 10 sm&#39;lik plaka içinde kendi Extraembryonic membranlarla embriyolar aktarın. </li><li> Sarısı kesesi ve amniyon çıkarın. NOT: Bu noktadan itibaren, alttan transillüminasyon ile stereomicroscope altında çalışmak; diseksiyon adımlarla büyütme artmaktadır. Kesme aletleri gibi cam kılcal tungsten iğneler kullanın. </li><li> Gibi iğneler kullanarakBir bıçak ve çatal, üst çene ve kulak (a boyunca kesilir Şekil 1A) de dahil olmak üzere, başın üst kısmını çıkarmak. </li><li> Sırtında embriyo tutun ve ilk nöral tüp ilave bir parça (b boyunca kesilir Şekil 1A), embriyo daha sonra alt kısmı, sadece ön bacaklarda altında ve kalp (Şekil 1B) yukarı kaldırın. </li><li> HBSS içeren yeni bir 10 sm&#39;lik plaka içinde dil (doku yönlendirmek için) ve boyun bölgesini içeren embriyo dilim aktarın. </li><li> Nöral tüp çıkarın ve dokular (Bir boyunca kesilir Şekil 1C) yemek borusu / trakea posterior. </li><li> Yavaşça bölüm (b ve b &#39;birlikte kesme Şekil 1C) dilin her iki tarafın birlikte doku dilim. </li><li> Dilin uzaması, özefagus ve trakea bulun ve (Şekil 1D bir birlikte kesme), ve bot üzerindeki dokuların şişmesine Aritenoid bırakarak, dil uzak teşrih(b ve b &#39;birlikte kesme Şekil 1D) yemek borusu / trakea h yanları. </li><li> Yemek borusu çıkarın ve ventral yüzü yukarı bakacak trakea yerleştirin. </li><li> Böyle timus (Şekil 1E) ve yutak kemer arterlerin lateral bulunan tüm dokular gibi istenmeyen dokuların uzak teşrih. (Şekil 1F; kırmızı noktalı çizgiler) E13.5 veya E14.5 embriyolar için, trakea her tarafında tiroid lobları görselleştirmek ve daha trakea lobları teşrih. </li><li> Antibiyotik, glutamin ve% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş, önceden ısıtılmış M199 ortamı ihtiva eden bir 35 mm kültür levhası içine izole edilmiş E12.5 trakea bölge veya E13.5-E14.5 tiroid lobları aktarın. P-200 mikropipet bir önceden filtre ucu kullanarak eksplantlar aktarın. E12.5 eksplantlar için, açılış genişletmek için ucunun ekstremite kesti. NOT: embriyolar aynı genotipi varsa Rutin ve tüm embriyolar üzerinde adımları 6 &amp; 7 gerçekleştirmek,n, 9-11, ve son olarak da 12 ve 13. </li></ol> Tiroid Eksplantlarından 3. Kaplama ve Kültür <ol><li> Önceden ısıtılmış kültür ortamı, 1 ml ihtiva eden bir 24-yuvalı plakanın üç kuyu ardışık transferi ile eksplantların yıkayın (= M199 antibiyotik, glutamin ve% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiştir). </li><li> Kaplı mikroskopi plastik kültür odalarına tiroid lobu Kaplama: <ol><li> Kaplanmış odalarından aspire M199 kültür ortamı. </li><li> Dikkatle, bir mikropipet ve filtre ipuçlarını kullanarak kültür odalarına tiroid eksplantlarının aktarın. Her bir bölmenin ortasına bir eksplant yerleştirin. </li><li> Aşırı Ortamı çıkarın ve bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde kültür odası yer (37 ° C,% 5 CO2), 2 saat boyunca, eksplantlar matrise takmak izin. </li><li> Yavaşça her kuyuya, önceden ısıtılmış kültür ortamının 200-300 ul ekle. </li><li> Doku kültürü inkübatörü içinde, uzun dönemli kültür inkübe edin. </li></ol></li><li> Kaplama oyarı macunsu filtreleri f trakea bölge veya tiroid lobu: <ol><li> Önceden ısıtılmış kültür ortamının 330 ul gereklidir, 24 gözlü bir levhanın gözleri sayısının doldurun. </li><li> Kültür filtrenin altında hava kabarcıkları yakalama önlemek için özen ortamında yer filtreler (örneğin 0.4 mikron Millipore filtresi). </li><li> Dikkatle, bir mikropipet ve filtre ipuçlarını kullanarak, filtrelerin merkezine (maksimum 4/filter) üzerine orta bir minimal hacimde tiroid eksplantlar aktarın. </li><li> Tungsten iğne ile eksplantlardan dışarı orta ve uzayın aşırı çıkarın. </li><li> Doku kültürü inkübatörü içinde, uzun dönemli kültür inkübe edin. NOT: laminer akış kaputun altında Change kültür ortamı her gün. 7 güne kadar Kültür eksplantlan. </li></ol></li></ol> Tiroid Eksplantlarından 4. Tüm montaj İmmünofloresan Boyama Protokolü Tungsten iğneler kullanılarak veya (aşağıda 2 adımından sonra) filtreler üzerinde yetiştirilen eksplantlarını bağdakiince forseps ve primer (aşama 5) ve ikinci (basamak 7) antikor inkübasyonunun (96 çukurlu plaka) hariç tüm adımları, için bir 24-çukurlu plaka içinde transferi. Mikroskopi plastik odalarına kültüre yapışık eksplantlanndakinden, kültür odalarında tüm adımları uygulayın. <ol><li> Aspire M199 kültür ortamı, 20 dakika boyunca (24 çukurlu tabak 500 ul ve mikroskopi slaytlar olarak 300 ul), buz soğukluğunda% 4 paraformaldehit (PFA) ile eksplant sabitleyin. </li><li> Triton ile Tris Tamponlu Salin içinde 2 x 10 dakika yıkayın (TBST, 50 mM Tris HCI pH 7.5, 150 mM NaCl,% 0.1 Triton X-100), oda sıcaklığında karıştırıldı. </li><li> -20 ° C&#39;de hemen eksplantlarm veya mağaza Süreç Not: -20 ° C de, uzun süreli depolama için, kademeli olarak% 100 metanol ulaşmak için TBST içerisinde metanol konsantrasyonunu arttırarak, metanol içinde eksplantlar kurutmak. Hazır imüno (aşama 4) ile devam etmek için, yavaş yavaş metanol TBST ekleyerek eksplantlar rehidrate. </li><li> Bloklama çözeltisi (% 10 TBST içerisinde normal keçi serumu ile TBST yerine) Ve oda sıcaklığında, 30-60 dakika boyunca bir deniz testere rocker üzerinde inkübe edilir. </li><li> (Koşul başına 100-200 ul) çözümü engelleme birincil antikor sulandırmak. 96 oyuklu bir plaka, 24-çukurlu plaka &quot;filtre&quot; eksplantlar aktarın. 4 ° C&#39;de gece boyunca bir deniz testere rocker primer antikorlar ile inkübe eksplantlar </li><li> Ertesi gün, birincil antikor solüsyonu atın arka bir 24-çukurlu plaka içindeki &quot;filtre&quot; eksplantlar transferi ve 45-60 dakika oda sıcaklığında her biri için bir deniz testere rocker TBST ile en az beş kez yıkayın. </li><li> Normal keçi serumu,% 1 ihtiva eden TBST içinde sekonder antikor (1:2,000 seyreltmede örneğin keçi anti-X-Alexa Fluor) seyreltilir ve 4 ° C&#39;de ve karanlıkta bir deniz testere rocker gece boyunca bu seyreltme ile eksplantların inkübe edin. Nükleer counterstaining için, birlikte ikincil antikor çözeltisi ile bis-Benzimide (Hoechst) içinde 1 ug / ml içerir. </li><li> Ertesi gün, ikincil antikor çözüm atmak ve bir deniz gördüm üzerinde TBST&#39;yi 5x yıkayın45-60 dakika oda sıcaklığında her biri için rocker. Yıkama sırasında, karanlıkta eksplantlar tutun. </li><li> TBST yavaşça karanlıkta 4 ° C&#39;de gece boyunca dönen ek bir yıkama yapın. </li><li> Postfix 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de% 4 PFA içinde immunosteyn eksplantlar. </li><li> TBST ile 2x 10 dakika yıkayın. </li><li> -20 ° C de, uzun süreli depolama için ya da kademeli olarak metanol içinde% 100 transfer eksplantlar ya da hemen analiz. Filtreler üzerinde kültürlenmiş ve bir 24-çukurlu plaka içinde immunosteyn önce bir multiphoton veya konfokal mikroskobu ile analiz TBST ya da daha iyi floresan montaj ortamı ile bir mikroskopi bölmesi (örneğin LABTEK veya Ibidi) transfer için eksplantlar. </li></ol> Tiroid RNA 5. Ekstraksiyon Bir Rnase-serbest ortamda çalışmak. Bu nedenle, nükleik asit ve nükleaz ücretsiz pipet ipuçlarını kullanın ve kirletici ve RNases gelen tezgah ve ekipman hem de temizleyin. Fenol / kloroform dayalı olarak bu protokol, ilk adımı gerçekleştirinKimyasal bir başlık altında (1 ile 7). <ol><li> 1.5 ml tüp için tek kullanımlık bir havan tokmağı kullanılarak RNA ekstraksiyon çözeltisi 300 ul bir eksplant tiroid ya da iki tiroid lobları homojenize. In örnekleri arasında, etanol, daha sonra su, daha sonra,% 2 SDS içinde havan tokmağı yıkayın. </li><li> RNA ekstraksiyonu çözeltisi başka bir 100 ul, 10 saniye girdap ilave edin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 30 saniye vorteksleyin ve her numune için 20 ng tRNA ekleyin. </li><li> 1 dakika vorteksleyin ve kloroform içinde 80 ul ekle. </li><li> Vortex sert biçimde 30 saniye süre ile ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> Bir buzdolabında (4 ° C) santrifüjü içinde 19,000 x g&#39;de 15 dakika boyunca Spin. </li><li> Coprecipitant olarak glikojen 20 ug içeren bir tüpe dikkatli bir şekilde renksiz bir üst sulu faz transfer. </li><li> Vorteks ve% 100 izopropanol alkol 200 ul ekleyin. </li><li> 15-30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde Vortex ve 2-3 saat boyunca -20 ° C&#39;de ve 1 saat boyunca -80 ° C&#39;de RNA çökelti sağlar. </li><li> 19.000 ° C&#39;de 30 dakika boyunca Spin4 ° C&#39;de xg, ve yüzen ortadan kaldırır. </li><li> Pelet çıkarmak için, soğuk% 75 etanol ve vorteks 450 ul pelet yıkayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 19,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca Spin ve supernatant ortadan kaldırır. </li><li> 5 dakika için kaputun altında pelet kurulayın. </li><li> RNase-içermeyen su içinde 10 ul ile pelet yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. </li><li> Tahlil RNA konsantrasyonu, -80 ° C&#39;de mağaza veya ters gen ekspresyon analizi için uyarlamak. </li></ol>

<ol>
	<li>Colin, I. M., Denef, J. -. F., Lengel&#233;, B., Many, M. -. C., G&#233;rard, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+the+cell+biology+of+thyroid+angiofollicular+units.">Recent insights into the cell biology of thyroid angiofollicular units.</a> Endocr. Rev. 34 (2), 209-238 (2013).</li><li>Fagman, H., Andersson, L., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+mouse+thyroid+embryonic+vessel+contacts+and+parenchymal+growth+pattern+during+specification+budding,+migration,+and+lobulation.">The developing mouse thyroid embryonic vessel contacts and parenchymal growth pattern during specification budding, migration, and lobulation.</a> Dev. Dyn. 235 (2), 444-455 (2006).</li><li>Fagman, H., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+thyroid+gland.">Morphogenesis of the thyroid gland.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 323 (1), 35-54 (2010).</li><li>Fagman, H., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetics+of+early+thyroid+development.">Morphogenetics of early thyroid development.</a> J. Mol. Endocrinol. 46 (1), (2011).</li><li>De Felice, M., Di Lauro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+development+and+its+disorders+genetics+and+molecular+mechanisms.">Thyroid development and its disorders genetics and molecular mechanisms.</a> Endocr. Rev. 25 (5), 722-746 (2004).</li><li>De Felice, M., Di Lauro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+factors+in+thyroid+gland+development:+an+update.">Intrinsic and extrinsic factors in thyroid gland development: an update.</a> Endocrinology. 152 (8), 2948-2956 (2011).</li><li>Hick, A. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+epithelial+paracrine+interactions+during+thyroid+development+govern+follicular+organization+and+C-cells+differentiation.">Reciprocal epithelial paracrine interactions during thyroid development govern follicular organization and C-cells differentiation.</a> Dev. Biol. 381 (1), 227-240 (2013).</li><li>Toda, S., Koike, N., Sugihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+integration+of+thyrocytes+and+thyroid+folliculogenesis:+a+perspective+for+thyroid+tissue+regeneration+and+engineering.">Cellular integration of thyrocytes and thyroid folliculogenesis: a perspective for thyroid tissue regeneration and engineering.</a> Endocr. J. 48, 407-425 (2001).</li><li>Toda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+models+for+studying+thyroid+biology+and+disorders.">Culture models for studying thyroid biology and disorders.</a> ISRN Endocrinol. , (2011).</li><li>Eggo, M. C., Quiney, V. M., Campbell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+factors+regulating+growth+and+function+of+human+thyroid+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Local factors regulating growth and function of human thyroid cells in vitro and in vivo.</a> 213, 47-58 (2003).</li><li>Antonica, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+thyroid+from+embryonic+stem+cells.">Generation of functional thyroid from embryonic stem cells.</a> Nature. 491, 66-71 (2012).</li><li>van Eyll, J. M., Pierreux, C. E., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shh-dependent+differentiation+of+intestinal+tissue+from+embryonic+pancreas+by+activin+A.">Shh-dependent differentiation of intestinal tissue from embryonic pancreas by activin A.</a> J. Cell Sci. 117, 2077-2086 (2004).</li><li>Hick, A. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands:+a+role+for+SDF-1.">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9. , (2009).</li><li>Pierreux, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial:Endothelial+cross-talk+regulates+exocrine+differentiation+in+developing+pancreas.">Epithelial:Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas.</a> Dev. Biol. 347, 216-227 (2010).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging.">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li><li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+ex-vivo+culturing+of+embryonic+pancreas.">A system for ex-vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Watanabe, T., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+ureteric+bud+branching+morphogenesis+in+vitro.">Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis in vitro.</a> Dev. Biol. 271, 98-108 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu çalışma, kesme ve tiroid oluşumuna yol açan karmaşık olay çalışma ve daha iyi anlamak amacıyla, tiroid eksplantlar (E12.5) ya da loblar (E14.5) kültürlenmesi için bir yöntem tarif etmektedir. Nedeniyle tiroid anlagen (orta hat anlage ve iki yanal ultimobranchial organları) ve kendi küçük boyutu, yutak kemer arterlere E12.5 doku lokalize rostral bir parçası, ve trakea içeren, ancak yemek borusu ikili kökeni microdissected edilir. Gösterildiği gibi, dört günlük bir süre içinde, bu kültür...

Tiroid bezi endotel kılcal damarların yoğun bir ağ ile çevrili folikül denilen bağımsız epitel küreler bir bütünüdür. Bu örgüt, tiroid fonksiyon verir: endotel kapilerler T3 ve T4 hormon sentezi için gerekli olan iyot ile tirositler sağlamak, ve tüm vücuda bu son dağıtmak. Foliküllerinin ve kılcal arasında dağınık, C-hücreleri 1 kalsitonin Hipokalsemik hormonu üretir. Erişkin tiroid mimarisi ve fonksiyonları iyi bilinmesine rağmen, tiroid embriyonik gelişim (folikül oluşumu ve farklılaşma) dahil hücresel ve moleküler mekanizmalar çok anlaşılır olmaktan vardır. Embriyojenez sırasında, (Cı-hücrelerinin ataları damla şeklinde çıkıntılar olarak E11.5 de kaynaklanan sırasında projenitör embriyonik gün foregut endoderm ventral duvarının kalınlaşması (orta hat anlage) (e) fare embriyo 8.5, olarak çıkar tirositler ultimobranchial boDördüncü faringeal torbalar 2-6) ölür. Orta hat tomurcuk daha sonra, endoderm ayrılır trakea her tarafında ultimobranchial organları ile E13.5 kaynaştırmak için bilateral genişler. Son olarak, tirositler foliküllerinin düzenlemek ve C-hücreleri ayırt. Tiroid oluşumu üzerinde akım bilgisi temel olarak sabit dokuların histolojik analiz gelmektedir, ancak tiroid oluşumunda rol oynayan morfojenik olaylar yüksek dinamik ve farklı hücre tipleri arasında ve hücre dışı matris ile iletişimi ve etkileşimleri içerir. Son çalışmalar tirosit progenitorlar gelişmekte olan tiroid endotel hücrelerini işe VEGF&#39;nin yüksek düzeylerde üretilmesi, ve buna bağlı olarak, endotel hücreleri folikül oluşumunu teşvik etmek ve C-hücrelerinin farklılaşma 7 işe gösterdi. Tiroid üzerinde en ex vivo çalışmalar hem 2D doku kültürü plastik d yetişen, izole erişkin tiroid kaynaklı hücreler üzerinde yapılmıştırishes veya 3D matrislerde. Bu tür kültürlerin, farklılaşmış foliküler hücreleri polarize kalır ve folikül olarak düzenlenen veya 3D organizasyon 8-10 reacquire kullanarak. Ancak, fizyolojik bir ortamda eksplante ve 2D kültürlenmiş, bu saf epitel hücreler, hücre dışı matris, sitokinler, büyüme faktörleri ve normal olarak in vivo olarak karşılaştıkları gibi endotel veya sinir hücreleri gibi diğer hücre tipleri ile etkileşimi yok sayar. Çok güzel bir çalışma, son zamanlarda 3D matrigel 11 bir son kültür adımı kullanarak tiroid foliküllerinin ES hücrelerinin bir farklılaşma protokol nitelendirdi. Bununla birlikte, bu 3D kültürler diğer hücre tipleri ile temas yoksundur. Pankreas ve tükrük önceki uzmanlığa dayalı bir organ kültürü 12-14, fare embriyonik tiroid Anlagen diseksiyon ve yarı macunsu filtrelerde veya mikroskopi plastik kızaklar üzerinde eksplantlarm için bir yöntem bezleri geliştirilmiştir. Ne zamanE12.5 embriyolar ile çalışan tiroid anlagen (orta hat anlage ve iki yanal ultimobranchial organları) ikili kökeni dokusunun büyük bir parçasının mikrodiseksiyon empoze. Bu trakea, ancak yemek borusu bulunan ve aritenoid şişme kadar faringeal kemer arterlerden uzatıldı. Filtreler üzerinde kültürlenmiştir zaman yine de dar bir kıstak tarafından bağlanan iki tiroid lobları, meydana getirmek üzere ultimobranchial organlarla sigorta burada, orta hat Anlage, trakea her iki tarafına yatay olarak uzanır. Kültüründe, epitel hücreler çoğalmaya folikül halinde organize ve kaynağına bağlı olarak, tirositlerin ve C-hücreleri içinde farklılık gösterir. Microdissected dokusunda bulunan endotel hücreleri çoğalır ve son olarak da, bağımsız bir şekilde kan akışının veya dolaşan faktörlerin foliküler epitel yapısı ile yakından ilişkilendirmek için tiroid lobları istila. Eksplantlarının gelişme sadakatle geliştirmek vivo özetlediği gibi,ment, bu kültür sistemi morfogenetik ve tiroid bezi gelişimi sırasında meydana gelen farklılaşma olayları incelemek için en uygunudur. Tiroid dokular vahşi tip, boşaltma ya da floresan transgenik embriyolardan elde edilebilir, ve kültür sistemi kaybı-ve kazanç-fonksiyon deneyleri elverişlidir. Son olarak, mikroskopi plastik tabaklar üzerinde floresan etiketli tiroid eksplantlarının zaman atlamalı görüntüleme daha iyi in vivo meydana kinetik ve morfogenetik hareketlerin devamlılığını araştırmak için yararlanılabilir. Zaman atlamalı görüntüleme önceden pankreas 15,16 ya da 17 ureterik gonca arasında dallanma morfolojilerinden incelemek için kullanılmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">&#181;-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile</td>
			<td style="width:85px;">proxylab</td>
			<td style="width:119px;">80826</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type I, rat tail</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td># 33010-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">M199</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">HBSS</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>14025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tungsten wire</td>
			<td style="width:85px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:119px;">LS237450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">culture plate insert (12 mm diameter)</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">E-cadherin</td>
			<td style="width:85px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610182</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Ezrin</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MS-661-P1</td>
			<td>1/400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">PECAM</td>
			<td style="width:85px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">550274</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Hoechst</td>
			<td style="width:85px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo culture system to study thyroid development

Tiroid tiroid hormonları T3, T4 ve kalsitonin üreten, boyun tabanında lokalize bir bilobated endokrin bezdir. Kalsitonin foliküllerinin ve kan kılcal yoğun bir ağ arasına serpiştirilmiş C-hücreleri tarafından sentezlenen ise T3 ve T4, folikül adlandırılan kapalı alanlarda düzenlenmiş farklı tirositlerin, tarafından üretilmektedir. Yetişkin tiroid mimari ve fonksiyonlar, kapsamlı olarak tarif ve incelenmiştir edilmiş olmasına rağmen, &quot;anjiyo-foliküler&quot; birimleri, parankimasında C-hücrelerinin dağılımı ve epitelyal ve endotelyal hücreleri arasındaki iletişimin parakrin oluşumu uzak anlaşılmalıdır değil. Bu yöntem yarı macunsu filtrelerinde veya mikroskopi plastik kızaklar üzerinde fare embriyonik tiroid anlagen diseksiyon ve kültürünün sıralı adımları açıklar. Dört günlük bir süre içinde, bu kültür sistemi sadakatle vivo tiroid geliştirme tartışıldı. Gerçekten de, (i) bilorganın obation (E12.5 eksplantlar için) ortaya çıkar, (ii) ön-maddeleri foliküllerine düzenlemek ve polarize, (iii) tirositler ve C-hücreleri ayırt eder, (iv) microdissected proliferatif doku içinde mevcut endotel hücreleri, içine göç tirositler Onlar in vivo gibi yakından tiroid lobları, ve, epitel hücreleri ile ilişkilendirmek. Tiroid dokular vahşi tip, boşaltma ya da floresan transgenik embriyolardan elde edilebilir. Dahası, immün ve RT-qPCR ile Ex vivo gelişimi gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir. Kültür antikorlar, büyüme faktörleri, ya da hücreler ya da şartlandırılmış ortam engelleme, inhibitör ilavesiyle manipüle edilebilir eksplant ya da kültürün her zaman. Aşağı bütün-mount veya bölümleri görüntüleme ve gen ekspresyon profili tiroid o bir morfogenetik ve farklılaşma olayları manipüle ve eğitim için güçlü bir sistem sağlar üzerinde kombine sonuç, tiroid eksplant kültürü içinderganogenesis.

Tiroid anlages (orta hat ve UB, birlikte çevre dokulara), ve tiroid lobları sırasıyla E12.5 ve e13.5/e14.5 fare embriyoları, (Şekil 1) disseke. Filtre üzerinde kültür bir gün sonra, orta hat anlage trakea üstüne yayılan uzun bir doku olarak (Şekil 2A) görülebilir. Bu giderek trakea her iki tarafında iki lobu oluşturur. Izole tiroid lobları (E13.5 veya E14.5) kültür varsa, bunlar, genişletmek morfolojilerinden ve epitel hücreler makroskopik olarak görülebilen fol...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development at JoVE.com

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kültür Sistemi Tiroid Geliştirme Çalışması

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

an-ex-vivo-culture-system-to-study-thyroid-development

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

11.4K Görüntüleme.  Université catholique de Louvain & de Duve Institute. This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Video: An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Bir Eski-ovo</emGörüntüleme ve Mikrocerrahi Uygulamaları için uygundur> Tavuk Embriyo Kültürü Sistemi

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

Gaz Geçirgen Malzeme Teknolojisi HYPERStack gemiler Kapalı Sistem Hücre Kültürü Protokolü

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

Yeni Bir<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Fare Kalp için&gt; Kültür Yöntemi

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Hücre-Hücre İletişim Yokluğunda iki Hücresel Türleri Ekleme Co-kültür Sisteminin Geliştirilmesi

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique tissue important for proper function of the synovial joint and is constituted by a dense extracellular matrix (ECM), rich in proteoglycan and type II collagen. Chondrocytes are the only cell type present within cartilage and are widespread and relatively low in number. Altered external stimuli and cellular signalling can lead to changes in ECM composition and deterioration, which are important pathological hallmarks in diseases such as osteoarthritis (OA) and rheumatoid arthritis.
Ex vivo cartilage models allow 1) profiling of chondrocyte mediated alterations of cartilage tissue turnover, 2) visualizing the cartilage ECM composition, and 3) chondrocyte rearrangement directly in the tissue. Profiling these alterations in response to stimuli or treatments are of high importance in various aspects of cartilage biology, and complement in vitro experiments in isolated chondrocytes, or more complex models in live animals where experimental conditions are more difficult to control.
Cartilage explants present a translational and easily accessible method for assessing tissue remodeling in the cartilage ECM in controllable settings. Here, we describe a protocol for isolating and culturing live bovine cartilage explants. The method uses tissue from the bovine knee, which is easily accessible from the local butchery. Both explants and conditioned culture medium can be analyzed to investigate tissue turnover, ECM composition, and chondrocyte function, thus profiling ECM modulation.

Here, we present a protocol describing isolation and culturing of cartilage explants from bovine knees. This method provides an easy and accessible tool to describe tissue changes in response to biological stimuli or novel therapeutics targeting the joint.

Sığır Diz Eksbitkilerinde Kıkırdak Remodeling Ex Vivo Doku Kültür Modeli

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...