Bu protokol, kan damarlarının oluşumunun birçok özelliğini özetleyen ve ilaçları test etmek için kullanılabilecek bir in vitro filizlenen anjiyogenez testini tanımlar. Bu yöntemin laboratuvarda uygulanması kolaydır, sağlam ve ölçeklenebilir. İnsan endotel hücrelerini ve mikrosferlerini kullanan tahlillerle birçok benzerliği vardır.
Bu model, patolojik anjiyogeneze yol açan kusurlu endotel ucu hücre seçimi ve yönlendirilmiş endotel hücre migrasyonunu gösteren fenotipi sağlam bir şekilde taklit eder. Çalışma, filizlenen anjiyogenezi, anahtar genleri ve özellikle genetik tarama yaparak ilgili sinyal yollarını düzenleyen mekanizmalar hakkında fikir verebilir Asıl zorluk, kültürdeki fare embriyonik kök hücrelerinin kalitesini veya pluripotensini korumaktır. Hücre hatlarının pluripotens aşamalarını ve morfolojisini düzenli olarak kontrol etmek önemlidir.
Hücre hatlarının karyotiplemesini yapmak da önemlidir, çünkü kromozomları kaybetme veya kazanma kültürüne eğilimlidirler. Altı kuyucuklu hücre kültürü plakasının bir kuyusunu 500 mikrolitre% 0.1 jelatin çözeltisi ile kaplayarak başlayın ve 30 dakika boyunca bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Daha sonra jelatin kaplı plakaları PBS ile yıkayın ve 500 mikrolitre taze hazırlanmış CM artı eksi orta ekleyin.
Saf bir fare embriyonik kök hücre veya mESC popülasyonu elde etmek için, hücre kültürü plakasını oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 10x TVP tamponu ile deneyin. Daha sonra, mESC'ler süspansiyonda kalırken fare embriyonik fibroblastlarının yapışmasına izin vermek için hücreleri bir mililitre mezoderm farklılaşma ortamında 30 dakika boyunca jelatin kaplı altı kuyucuk plakasına aktarmadan önce yeniden askıya alın. Tripan mavisi boyada bir Neubauer hemositometresi kullanarak canlı hücreleri saymadan önce hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüj edin. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini uygun bir mezoderm farklılaşma ortamında yeniden askıya alın. Tabana 15 mililitre steril su ekleyerek dört adet 94 milimetre düşük ataşmanlı polistiren tabak hazırlayın.
Hücre süspansiyonunu steril bir plastik hazneye aktardıktan sonra, kanal başına 22 mikrolitre hücre süspansiyonuna sahip çok kanallı bir pipetin dört pozisyonunu yükleyin. 94 milimetrelik çanağın ters çevrilmiş kapağını kaldırın ve iç tarafı yukarı bakacak şekilde akış kabininin temiz yüzeyine yerleştirin. Her kapağın iç yüzeyine 40 damla hücre süspansiyonu koyun ve damlaların suya bakması için kapağı tekrar tabağa yerleştirmek için rahatsız etmeden dikkatlice ters çevirin.
Bulaşıkları dört gün boyunca bir karbondioksit inkübatöründe inkübe edin, bunu farklılaşma günü sıfır olarak düşünün. Dört günlük inkübasyondan sonra, asılı damlaları bir P1000 pipet kullanarak 15 mililitrelik bir konik tüpte toplayın. Süpernatanı çıkarmadan önce EB tortusunun tüpte olmasına izin verin.
EB süspansiyonunu 60 milimetrelik agar kaplı bir tabakta aktarmadan ve eşit olarak dağıtmadan önce EB'leri üç mililitre 2x vasküler farklılaşma ortamında tekrar askıya alın. Bulaşıkları bir karbondioksit inkübatöründe dokuzuncu güne kadar her iki günde bir orta tazeleme ile inkübe edin. Filizlenen ortamın bir mililitresini tabanına ekleyerek 35 milimetrelik bir kültür kabı hazırlayın.
Jelleşmeyi indüklemek için, yemeği beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 15 mililitrelik konik bir tüpte bir agar kabından dokuz günlük EB'leri toplayın ve süpernatanı çıkarın. EB'leri, ilk filizlenme ortamı tabakasıyla kaplanmış kültür kabına aktarmak için iki mililitre soğuk filizlenme ortamında tekrar askıya alın.
EB'leri plakanın her yerine dağıtın ve birbirlerinden eşit mesafede olduklarından emin olun. İlk filiz oluşumu, inkübasyondan sonra yaklaşık 24 ila 48 saat boyunca belirgin olmalıdır. 12. günde, EB'leri içeren kollajen jelini dikkatlice bir cam slayda aktarmak için bir spatula kullanın.
Fazla sıvıyı bir pipetle çıkarın ve jelin üzerine bir gazlı bez tabakası naylon keten ve emici filtre kartları yerleştirerek jeli kurutun. İki dakika boyunca 250 gram ağırlığında basınç uygulayın. Ardından, slaytların oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kurumasını sağlamak için naylon kağıtları çıkarın.
Kuruduktan sonra, EB'leri gece boyunca dört santigrat derecede çinko çözeltisi kullanarak sabitleyin. Ertesi gün, slaytları PBS ile beş kez yıkamadan önce fiksatifi çıkarın. %0.1 Triton X-100 içeren EB ve PBS'leri geçirgenleştirin.
15 dakika sonra, slaytları PBS ile beş kez beş dakika boyunca yıkamak için geçirgenlik solüsyonunu çıkarın. EB'leri bloke edici tamponda oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin ve PBS ile beş dakika yıkayın. Daha sonra bloke edici tamponda seyreltilmiş birincil antikoru ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra slaytları oda sıcaklığında iki saat boyunca bir bloke edici tamponda Goat anti-Rat Alexa 555 sekonder antikoru ile inkübe edin. Kuluçkadan sonra, slaytları mikroskopi için monte etmeden önce PBS ile beş dakika boyunca üç kez ve bir kez suyla yıkayın. 3D filizlenen anjiyogenez testi, DC101 ve DAPT olmak üzere iki ilaçla üç EB üzerinde gerçekleştirildi.
Her iki bileşik de EB modelindeki anjiyogenezi artan konsantrasyonlarla aşamalı olarak bloke etti. EB'lerdeki çeşitli ilaç konsantrasyonları, yüksek dozda DC101'in damar filizlerinin sayısını ve uzunluğunu inhibe ettiğini göstermiştir. DAPT, litre başına bir mikromol dozunda zıt etkilere sahipti.
DAPT, DC101'e kıyasla, düşük dozlarda bile yanlış yönlendirilmiş bir fenotipe sahip damar filizi başına endotel ucu hücrelerinin sayısını güçlü bir şekilde arttırmıştır. ACVRL1 kontrolünden kalıtsal hemorajik telanjiektazi EB'lerinde ve ACVRL1 heterozigot genotiplerinde ana damarlara göre rastgele açılarda filizlenen çok sayıda yanlış yönlendirilmiş fenotiple birlikte kusurlu damar filizlenmeleri gözlendi. Vahşi tip bir mESC hattının, etiketlenmemiş bir mESC vahşi tip çizgi ile bire bir oranda karışımları, önde gelen endotel ucu hücrelerine eşit bir katkı sağlamıştır.
Bu temsili kimerik EB'nin mikroskobik analizi, önde gelen endotel ucu hücrelerinin genotipik kökenini tanımlamak için yapıldı. Damar filizinin duvar hücresi kapsamını ölçmek için, EB'ler endotel hücre belirteçleri, PECAM ve duvar hücresi belirteci, alfa düz kas aktini için sabitlendi ve boyandı. Yüksek büyütmeli bir görüntü, tek bir damar filizinin duvar hücreleri ile çevrili olduğunu ortaya koydu.
İkili transformasyon renk kanalı ayrımından sonra yapıldı ve alfa SMA pozitif mural hücrelerin kapladığı PECAM pozitif damarların oranı ölçüldü. Embriyonik kök hücre hattının genetik arka planı, araştırmacıların bazı çizgilerin diğerlerinden daha iyi filizlendiği için göz önünde bulundurmaları gereken önemli bir faktördür. Bu yöntem, RNAi yaklaşımları veya gen mutasyonlarını barındıran bir fare embriyonik kök hücre bankası kullanılarak genetik tarama yapmak için kullanılabilir.
