Bu yöntem, yeni oftalmik ürün formülasyonlarının in vitro toksisitesini değerlendirmek için kullanılabilir. Oküler hücreler in vitro kullanılarak kimyasalların ve ürün formülasyonlarının konsantrasyonlarının rafine edilmesiyle, yeni ürün güvenliğini değerlendirmek için hayvanların kullanımı en aza indirilebilir. İn vitro testler, bir kimyasalın mitokondriyal fonksiyon, hücre zarı bütünlüğü ve enzim aktivitesi üzerindeki etkisini belirlemek gibi in vivo olarak değerlendirilemeyen toksisite son noktalarını değerlendirir.
Hücre toksisitesini in vitro olarak değerlendirmek, potansiyel toksisite mekanizmalarını anlamanın anahtarıdır. Bu, gözde tolere edilebilir maksimum dozda terapötik kimyasalların oluşturulması için gereklidir. Prosedürü gösteren, Jones Laboratuvarı'ndan bir araştırmacı olan Nijani Nagaarudkumaran olacak.
Hem pHCEC'leri hem de iHCEC'leri, 1 mililitre insan oküler epitel ortamı veya HOEM ile 1 x 10 ila 5. konsantrasyonda cam alt kapak kaymaları olan kollajen kaplı Petri kaplarına yerleştirerek başlayın. pHCEC'leri ve iHCEC'leri 24 saat boyunca 1 kültür seti ve 48 saat boyunca başka bir seti% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derecelik bir inkübatörde büyütün. İnkübasyondan sonra, hücreleri 4 mikromolar kalsein, 8 mikromolar ethidyum homodimer 1 ve anneksin 5 içeren 500 mikrolitre annexin boyama tampon çözeltisi ile 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca boyayın.
Hücreleri boyadıktan sonra, metin el yazmasında açıklandığı gibi uyarma ve emisyon dalga boylarını yakalamak için konfokal lazer tarama mikroskobunu ayarlayın. Makaledeki talimatları izleyerek iki boyutlu ve üç boyutlu görüntüleri elde edin. Hücreleri, 24 kuyucuklu kollajen 1 kaplı bir kültür plakasının her bir kuyucuğunda mililitre HOEM başına 5 x 10 ila 4. sırada tohumlayın ve 3 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, kuyucuklardaki ortamın hacmini 300 mikrolitreye düşürün. Daha sonra, hücreleri ayrı deneylerde 5 ve 20 dakika boyunca metrekare başına 6.48 watt'ta UVA radyasyonuna ve 37 santigrat derecede metrekare başına 1.82 watt'ta UVB radyasyonuna maruz bırakın. UV radyasyonundan sonra, her bir kuyucuğa 200 mikrolitre taze HOEM ekleyin ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 20 saat boyunca inkübe edin.
Ertesi gün, hücre süpernatantını her bir kuyucukta toplayın ve steril 2 mililitrelik polipropilen tüplere aktarın. Süpernatantı eksi 80 santigrat derecede dondurun. UV maruziyetinden sonra pHCEC'ler ve iHCEC'ler tarafından salınan sitokin seviyelerini belirlemek için, bir multipleks sitokin testi kullanın ve interlökin 6, interlökin 8, interlökin-1 beta ve TNF-alfa'yı ölçmek için kitin talimatlarını izleyin.
DMEM ve F12'de% 10 metabolik tahlil reaktifi hazırlayın. Her bir kuyucuktaki kültür ortamını% 10'luk metabolik tahlil çözeltisinin 1 mililitresi ile değiştirin ve 4 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Her çözeltinin floresansını 530 nanometre uyarma ve 590 nanometre emisyon dalga boylarında bir floresan plaka okuyucu kullanarak ölçün.
24 kuyucuklu kollajen 1 kaplı kültür plakasının her bir kuyucuğunda mililitre HOEM başına 5 x 10 ila dördüncü tohum hücreleri. 3 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri% 0.001 benzalkonyum klorür veya BAK,% 0.01 hidrojen peroksit ve% 0.0025 sodyum dodesil sülfat içeren 1 mililitre kimyasal toksine maruz bırakın.
Kimyasal toksinlere maruz kaldıktan sonra, toksinleri kuyucuklardan çıkarın, 1 mililitre PBS ile durulayın ve her bir oyuğa 1 mililitre HOEM ekleyin. 20 saatlik inkübasyondan sonra, ortamı% 10'luk bir metabolik tahlil çözeltisinin 1 mililitresi ile değiştirerek ve 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 4 saat boyunca inkübe ederek metabolik bir tahlil gerçekleştirin. Her çözeltinin floresansını 530 nanometre uyarma ve 590 nanometre emisyon dalga boylarında bir floresan plaka okuyucu kullanarak ölçün.
20 saatlik inkübasyonu takiben hücre süpernatantlarını kuyucuklardan ayrı steril 2 mililitrelik polipropilen tüplere aktarın ve eksi 80 santigrat derecede dondurun. İnterlökin 6, interlökin 8, interlökin-1 beta ve TNF-alfa'yı ölçmek için kitin talimatlarını izleyerek UV ile muamele edilmiş hücrelerden sitokinleri değerlendirmek için kullanılan aynı multipleks platformunu kullanın. 24 kuyucuklu kollajen 1 kaplı kültür plakasının her bir kuyucuğunda mililitre HOEM başına 1 x 10 ila 5. tohum hücreleri ve 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edilir.
İnkübasyondan sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri 5 dakika boyunca PBS'de% 0.001 BAK,% 0.005 BAK ve% 0.01 BAK dahil olmak üzere 1 mililitre kimyasal toksine maruz bırakın. Maruz kaldıktan sonra, kimyasal toksinleri çıkarın, kuyucukları 1 mililitre PBS ile durulayın ve her bir oyuğa 1 mililitre HOEM ekleyin. 20 saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca kalsein, ethidyum homodimer ve eksin 5 içeren 500 mikrolitre ekin boyama tamponu çözeltisi ile boyayın.
Ek 5, kalsein için 495 ve 515 nanometre ve ethidyum 1 boyama için 528 ve 617 nanometre uyarma ve emisyon dalga boylarındaki yoğunlukları ölçmek için mikroskobu ayarlayın. Daha sonra floresan mikroskobu kullanarak hücrelerin görüntülerini elde edin. İHCEC'lerin 10 ila 20 mikrometre arasında değişen küçük hücreler olduğu ve pHCEC'lerin 24 saatlik büyümeden sonra 20 ila 50 mikrometre aralığında olduğu bulundu.
48 saatlik büyümeden sonra iHCEC'ler ve pHCEC'ler için boyut aralığında benzer farklılıklar gözlenmiştir. UV'ye maruz kalmayan hücrelerle karşılaştırıldığında, ışınlanmış pHCEC'lerin metabolik aktivitesi 20 dakikalık maruziyette önemli ölçüde azalmıştır. İHCEC'ler için, hem 5 hem de 20 dakikada ışınlanan hücreler için metabolik aktivite azalmıştır.
Bu nedenle, pHCEC'lerin metabolik aktivitesini azaltmak iHCEC'lerden daha uzun bir maruz kalma süresi aldı. İHCEC'ler tarafından maksimum sitokin salınımı 5 dakikalık UV maruziyetinde idi. pHCEC'ler için maksimum sitokin salınımı 20 dakikalık UV maruziyetinde meydana geldi.
Toplam inflamatuar sitokin miktarları açısından, pHCEC'ler iHCEC'lerden önemli ölçüde daha fazla interlökin-1 beta, interlökin 8 ve TNF-alfa salgılarken, iHCEC'ler daha fazla interlökin 6 salgıladı. Hem pHCEC'ler hem de iHCEC'ler, her üç kimyasala maruz kaldıktan sonra interlökin 6 salınımında bir değişiklik gösterdi. BAK, hem primer hem de ölümsüzleştirilmiş HCEC'lerin kontrolüne kıyasla interlökin 6 salınımında bir azalmaya neden olmuştur.
Hidrojen peroksit, iHCEC'lerden interlökin 6 salınımında bir artışa ve pHCEC'lerden salınımda bir azalmaya neden olmuştur. Hem pHCEC'ler hem de iHCEC'ler BAK'ın %0.005'inde ve %0.1'inde önemli ölçüde hasar görmüştür. Oküler hücre toksisitesinin in vitro değerlendirmeleri yapıldıktan sonra, bir oküler ürünün kornea sinirleri veya oküler bağışıklık sistemi üzerindeki etkisini belirlemek için oküler toksisitenin başka hayvan modelleri de yapılabilir.
Bu teknikler, gözdeki kimyasal ve ürün formülasyonu toksisitesinin mekanizmalarını belirlemek için gereklidir ve ürün geliştirme testleri için hayvan kullanımını en aza indirmeye yardımcı olacaktır.
