この方法は、新しい眼科用製品製剤の毒性をin vitroで評価するために使用できます。in vitroで眼細胞を使用して化学物質や製品製剤の濃度を精製することにより、新製品の安全性を評価するための動物の使用を最小限に抑えることができます。インビトロアッセイは、ミトコンドリア機能、細胞膜の完全性、酵素活性に対する化学物質の影響を決定するなど、in vivoでは評価できない毒性エンドポイントを評価します。
in vitroで細胞毒性を評価することは、毒性の潜在的なメカニズムを理解するための鍵です。これは、眼内の治療用化学物質の最大耐量を確立するために不可欠です。.手順を実演するのは、ジョーンズ研究所の研究者であるニジャニ・ナガルドクマランです。
まず、pHCECとiHCECの両方を、1ミリリットルのヒト眼上皮培地(HOEM)を使用して、1 x 10から5番目の濃度のガラス底カバースリップを備えたコラーゲンコーティングされたペトリ皿に装着します。pHCECとiHCECを1セットの培養物を24時間、別のセットを5%二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターで48時間培養します。インキュベート後、4マイクロモルのカルセイン、8マイクロモルのエチジウムホモダイマー1、およびアネキシン5を含む500マイクロリットルのアネキシン染色緩衝液で細胞を摂氏37度で20分間染色します。
細胞を染色した後、共焦点レーザー走査型顕微鏡を調整して、テキスト原稿に記載されているように、励起波長と発光波長をキャプチャします。原稿の指示に従って、2次元および3次元の画像を取得します。24ウェルコラーゲン1コーティング培養プレートの各ウェルにHEMOM1ミリリットルあたり5 x 10から4番目の細胞を播種し、摂氏37度で5%二酸化炭素で3時間インキュベートします。
インキュベーション後、ウェル内の培地の容量を300マイクロリットルに減らします。次に、細胞を6.48ワット/平方メートルのUVA放射と、摂氏1.82度で1平方メートルあたり37ワットのUVB放射に5分間と20分間さらします。UV照射後、200マイクロリットルの新鮮なHEMOを各ウェルに加え、5%二酸化炭素で摂氏37度で20時間インキュベートします。
翌日、各ウェルに細胞上清を集め、それを滅菌2ミリリットルのポリプロピレンチューブに移します。上清をマイナス80°Cで凍結します。UV曝露後にpHCECおよびiHCECによって放出されるサイトカインレベルを決定するには、マルチプレックスサイトカインアッセイを使用し、キットの指示に従ってインターロイキン6、インターロイキン8、インターロイキン-1ベータ、およびTNF-αを定量します。
DMEMおよびF12で10%代謝アッセイ試薬を調製します。各ウェルの培養液を1ミリリットルの10%代謝アッセイ溶液と交換し、摂氏37度で5%二酸化炭素で4時間インキュベートします。蛍光板リーダーを使用して、530ナノメートルの励起波長と590ナノメートルの発光波長で各溶液の蛍光を測定します。
細胞を24ウェルコラーゲン1コーティング培養プレートの各ウェル中のHEMOMの5x10〜4ミリリットルで播種する。摂氏37度で5%の二酸化炭素で3時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を除去し、細胞をPBS中の0.001%塩化ベンザルコニウム、またはBAK、0.01%過酸化水素、および0.0025%ドデシル硫酸ナトリウムを含む1ミリリットルの化学毒素に5および15分間さらします。
化学毒素にさらされた後、ウェルから毒素を取り除き、1ミリリットルのPBSですすぎ、各ウェルに1ミリリットルのHOUMを加えます。20時間のインキュベーション後、培地を1ミリリットルの10%メタボリックアッセイ溶液に交換し、摂氏37度で5%二酸化炭素で4時間インキュベートすることにより、メタボリックアッセイを実行します。蛍光板リーダーを用いて、530ナノメートルの励起、および590ナノメートルの発光波長で各溶液の蛍光を測定します。
20時間のインキュベーション後のウェルから細胞上清を別々の滅菌2ミリリットルポリプロピレンチューブに移し、摂氏マイナス80度で凍結します。キットの指示に従って、UV処理細胞からのサイトカインを評価するために使用されるのと同じマルチプレックスプラットフォームを使用して、インターロイキン6、インターロイキン8、インターロイキン-1ベータ、およびTNF-アルファを定量します。24ウェルコラーゲン1コーティング培養プレートの各ウェルにHOEM1ミリリットルあたり1 x 10から5番目の細胞を播種し、摂氏37度で5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。
インキュベーション後、培地を取り出し、細胞をPBS中の0.001%BAK、0.005%BAK、および0.01%BAKを含む1ミリリットルの化学毒素に5分間さらします。暴露後、化学毒素を取り除き、1ミリリットルのPBSでウェルをすすぎ、各ウェルに1ミリリットルのHOEMを加えます。20時間のインキュベーション後、カルセイン、エチジウムホモ二量体、およびアネキシン5を含む500マイクロリットルのアネキシン染色バッファー溶液で細胞を摂氏37度で20分間染色します。
顕微鏡を調整して、アネキシン5の場合は630および675ナノメートル、カルセインAMの場合は495および515ナノメートル、エチジウム1染色の場合は528および617ナノメートルの励起波長および発光波長での強度を測定します。次に、蛍光顕微鏡を使用して細胞の画像を取得します。iHCECは10〜20マイクロメートルの範囲の小さな細胞であり、pHCECは24時間の増殖後に20〜50マイクロメートルの範囲にあることがわかりました。
サイズ範囲の同様の違いは、48時間の増殖後にiHCECとpHCECで観察されました。非UV曝露細胞と比較して、照射されたpHCECの代謝活性は、曝露の20分で有意に低下した。iHCECの場合、5分と20分の両方で照射された細胞の代謝活性が低下しました。
したがって、iHCECよりもpHCECの代謝活性を低下させるのに長い曝露時間を要した。iHCECによるサイトカインの最大放出は、UV曝露の5分時でした。pHCECの最大サイトカイン放出は、UV曝露の20分で発生しました。
放出された炎症性サイトカインの総量に関しては、pHCECはiHCECよりも実質的に多くのインターロイキン-1ベータ、インターロイキン8、およびTNF-αを放出しましたが、iHCECはより多くのインターロイキン6を放出しました。pHCECとiHCECの両方が、3つの化学物質すべてに曝露した後のインターロイキン6の放出に変化を示しました。BAKは、一次および不死化HCECの両方の対照と比較して、インターロイキン6の放出の減少を引き起こした。
過酸化水素は、iHCECからのインターロイキン6の放出の増加、およびpHCECからの放出の減少を引き起こした。pHCECとiHCECの両方がBAKの0.005%と0.1%で有意な損傷を受けました。眼細胞毒性のin vitro評価を行った後、眼毒性のさらなる動物モデルを実施して、角膜神経または眼免疫系に対する眼産物の効果を決定することができます。
これらの技術は、眼に対する化学物質および製品製剤の毒性のメカニズムを決定するために不可欠であり、製品開発試験のための動物の使用を最小限に抑えるのに役立ちます。
