确定紫外线辐射和化学物质对原代和永生化的人角膜上皮细胞的毒性

该方法可用于体外评价新眼科产品制剂的毒性。通过在体外使用眼细胞精炼化学品和产品配方的浓度，可以最大限度地减少使用动物来评估新产品的安全性。体外测定评估无法在体内评估的毒性终点，例如确定化学物质对线粒体功能、细胞膜完整性和酶活性的影响。

体外评估细胞毒性是了解潜在毒性机制的关键。这对于确定眼睛中治疗性化学物质的最大可耐受剂量至关重要。展示该程序的将是琼斯实验室的研究员Nijani Nagaarudkumaran。

首先将pHCEC和iHCEC都放在胶原蛋白包被的培养皿上，玻璃底盖玻片浓度为1 x 10至第5个，含有1毫升人眼上皮培养基或HOEM。在含有 5% 二氧化碳的 37 摄氏度培养箱中培养 pHCEC 和 iHCEC 1 组培养物 24 小时，另一组培养 48 小时。孵育后，用含有4微摩尔钙黄绿素，8微摩尔乙锭同源二聚体1和膜联蛋白5的500微升膜联蛋白染色缓冲液在37摄氏度下染色细胞20分钟。

染色细胞后，调整共聚焦激光扫描显微镜以捕获激发和发射波长，如文本手稿中所述。按照稿件中的说明获取二维和三维图像。在 24 孔胶原蛋白 1 包被培养板的每个孔中以每毫升 HOEM 5 x 10 至 4 分之一接种细胞，并在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育 3 小时。

孵育后，将孔中培养基的体积减少至300微升。接下来，在单独的实验中，将细胞暴露在每平方米6.48瓦的UVA辐射下，在37摄氏度下以每平方米1.82瓦的UVA辐射照射5和20分钟。紫外线辐射后，向每个孔中加入200微升新鲜HOEM，并在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育20小时。

第二天，收集每个孔中的细胞上清液并将其转移到无菌的2毫升聚丙烯管中。将上清液冷冻在零下80摄氏度。要确定 pHCEC 和 iHCEC 在紫外线照射后释放的细胞因子水平，请使用多重细胞因子测定并按照试剂盒的说明量化白细胞介素 6、白细胞介素 8、白细胞介素-1 β 和 TNF-α。

在DMEM和F12中制备10%代谢测定试剂。用1毫升10%代谢测定溶液替换每个孔中的培养基，并在37摄氏度下与5%二氧化碳孵育4小时。使用荧光板读数器在530纳米激发和590纳米发射波长下测量每种溶液的荧光。

在24孔胶原蛋白1包被培养板的每个孔中以每毫升HOEM的5 x 10至第四种子细胞。在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳一起孵育 3 小时。孵育后，除去培养基并将细胞暴露于1毫升化学毒素中，其中包括PBS中的0.001%苯扎氯铵或BAK，0.01%过氧化氢和0.0025%十二烷基硫酸钠5和15分钟。

暴露于化学毒素后，从井中取出毒素，用1毫升PBS冲洗，并向每个孔中加入1毫升HOEM。孵育20小时后，通过用1毫升10%代谢测定溶液替换培养基并在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育4小时来进行代谢测定。使用荧光酶标仪在530纳米激发和590纳米发射波长下测量每种溶液的荧光。

孵育20小时后将细胞上清液从孔中转移到单独的无菌2毫升聚丙烯管中，并在零下80摄氏度下冷冻。按照试剂盒的说明，使用用于评估紫外线处理细胞的细胞因子的相同多重平台，以量化白细胞介素 6、白细胞介素 8、白细胞介素-1 β 和 TNF-α。在 24 孔胶原蛋白 1 包被培养板的每个孔中接种每毫升 HOEM 1 x 10 至 5 分之一的细胞，并在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳孵育 24 小时。

孵育后，除去培养基并将细胞暴露于 1 毫升化学毒素中，包括 PBS 中的 0.001%BAK、0.005% BAK 和 0.01% BAK 5 分钟。暴露后，去除化学毒素，用1毫升PBS冲洗孔，并向每个孔中加入1毫升HOEM。孵育20小时后，用含有钙黄绿素，乙锭同源二聚体和膜联蛋白5的500微升膜联蛋白染色缓冲溶液在37摄氏度下染色细胞20分钟。

调整显微镜以测量膜联蛋白 630 和 675 纳米的激发和发射波长下的强度，钙黄绿素 AM 的 495 和 515 纳米，以及乙锭 1 染色的 528 和 617 纳米。然后使用荧光显微镜获取细胞的图像。发现iHCEC是10至20微米范围内的小细胞，pHCEC在生长24小时后在20至50微米范围内。

在生长48小时后，iHCEC和pHCEC在大小范围内观察到类似的差异。与非紫外线暴露细胞相比，照射的pHCEC的代谢活性在暴露20分钟时显着降低。对于iHCEC，在5和20分钟照射的细胞的代谢活性降低。

因此，与iHCEC相比，降低pHCEC的代谢活性需要更长的暴露时间。iHCEC的最大细胞因子释放是在紫外线照射5分钟时。pHCEC的最大细胞因子释放发生在紫外线照射20分钟时。

就释放的炎性细胞因子总量而言，pHCEC释放的白细胞介素-1β、白细胞介素8和TNF-α明显高于iHCEC，而iHCEC释放的白细胞介素6更多。pHCEC和iHCEC在暴露于所有三种化学物质后都显示出白细胞介素6释放的变化。与原发性和永生化HCEC的对照组相比，BAK导致白细胞介素6的释放减少。

过氧化氢导致iHCEC中白细胞介素6的释放增加，以及pHCEC的释放减少。pHCEC和iHCEC均受到显著损害，分别为BAK的0.005%和0.1%。在对眼细胞毒性进行体外评估后，可以进行进一步的眼毒性动物模型以确定眼部产品对角膜神经或眼部免疫系统的影响。

这些技术对于确定化学和产品配方对眼睛的毒性机制至关重要，并有助于最大限度地减少动物在产品开发测试中的使用。