שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך במבחנה את הרעילות של ניסוחים חדשים של מוצרי עיניים. על ידי זיקוק ריכוזי כימיקלים ופורמולציות מוצרים באמצעות תאי עין במבחנה, ניתן למזער את השימוש בבעלי חיים להערכת בטיחות מוצרים חדשים. בדיקות In vitro מעריכות נקודות קצה רעילות שלא ניתן להעריך in vivo, כגון קביעת ההשפעה של כימיקל על תפקוד המיטוכונדריה, שלמות קרום התא ופעילות האנזים.
הערכת רעילות תאים במבחנה היא המפתח להבנת מנגנונים פוטנציאליים של רעילות. זה חיוני לקביעת מינון נסבל מקסימלי של כימיקלים טיפוליים בעין. מי שידגים את ההליך יהיה ניג'אני נאגארודקומרן, חוקר ממעבדת ג'ונס.
התחילו בהנחת pHCEC ו-iHCECs על צלחות פטרי מצופות קולגן עם כיסוי תחתון מזכוכית בריכוז של 1 x 10 עד ה-5 עם מיליליטר אחד של אפיתל עיני אנושי בינוני, או HOEM. לגדל pHCECs ו- iHCECs קבוצה אחת של תרביות במשך 24 שעות וקבוצה נוספת במשך 48 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה, מכתימים את התאים בתמיסת חיץ צביעה של 500 מיקרוליטר המכילה 4 קלצאין מיקרומולרי, 8 מיקרומולרי אתידיום הומודימר 1 ואנקטין 5 למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר צביעת התאים, התאימו את מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי כדי ללכוד את אורכי גל העירור והפליטה, כמתואר בכתב היד של הטקסט. השג את התמונות הדו-ממדיות והתלת ממדיות בהתאם להוראות בכתב היד. זרעו את התאים בגודל 5X10 עד 4 למיליליטר של HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן 1 של 24 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 3 שעות.
לאחר הדגירה, להפחית את נפח המדיום בבארות ל 300 מיקרוליטר. לאחר מכן, חשפו את התאים לקרינת UVA ב-6.48 וואט למ"ר, וקרינת UVB ב-1.82 וואט למ"ר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 ו-20 דקות בניסויים נפרדים. לאחר קרינת UV, יש להוסיף 200 מיקרוליטר של HOEM טרי לכל באר ולדגור במשך 20 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
למחרת, לאסוף את supernatant התא בכל באר ולהעביר אותו לתוך צינורות פוליפרופילן סטרילי 2 מיליליטר. מקפיאים את הסופרנאטנט במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לקבוע את רמות הציטוקינים המשתחררים על-ידי pHCECs ו-iHCECs לאחר חשיפה לקרינת על-סגול, השתמשו בבדיקת ציטוקינים מרובים ועקבו אחר הוראות הערכה כדי לכמת אינטרלוקין 6, אינטרלוקין 8, אינטרלוקין-1 בטא ו-TNF-אלפא.
הכן מגיב בדיקה מטבולית 10% ב- DMEM ו- F12. החלף את מדיום התרבית בכל באר במיליליטר אחד של תמיסת הבדיקה המטבולית 10% ודגר ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 4 שעות. מדוד את הפלואורסצנטיות של כל תמיסה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי באורכי גל עירור של 530 ננומטר ופליטה של 590 ננומטר.
תאי זרעים בגודל 5X10 עד הרביעי למיליליטר HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן 1 של 24 בארות. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 3 שעות. לאחר הדגירה, להסיר את המדיום ולחשוף את התאים 1 מיליליטר של רעלים כימיים, הכוללים 0.001% benzalkonium כלוריד, או BAK, 0.01% מי חמצן, ו 0.0025% נתרן דודציל סולפט ב PBS במשך 5 ו 15 דקות.
לאחר חשיפה לרעלים הכימיים, הסר את הרעלים מהבארות, שטוף עם 1 מיליליטר של PBS, ולהוסיף 1 מיליליטר של HOEM לכל באר. לאחר 20 שעות של דגירה, בצע בדיקה מטבולית על ידי החלפת המדיום עם 1 מיליליטר של תמיסת בדיקה מטבולית 10% ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 4 שעות. מדוד את הפלואורסצנטיות של כל תמיסה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי בעירור של 530 ננומטר, ובאורכי גל של פליטה של 590 ננומטר.
מעבירים את הסופרנאטנטים התאיים מהבארות לאחר הדגירה של 20 שעות לצינורות פוליפרופילן סטריליים נפרדים של 2 מיליליטר ומקפיאים אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמש באותה פלטפורמת מולטיפלקס המשמשת להערכת הציטוקינים מהתאים שטופלו ב- UV בהתאם להוראות הערכה לכימות אינטרלוקין 6, אינטרלוקין 8, אינטרלוקין-1 בטא ו- TNF-אלפא. זרעו תאים בגודל 1X10 עד 5 למיליליטר של HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן 1 של 24 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות.
לאחר הדגירה, הסר את המדיום וחשף את התאים למיליליטר אחד של רעלים כימיים, כולל 0.001% BAK, 0.005% BAK ו- 0.01% BAK ב- PBS למשך 5 דקות. לאחר החשיפה, להסיר את הרעלים הכימיים, לשטוף את הבארות עם 1 מיליליטר של PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של HOEM לכל באר. לאחר 20 שעות דגירה, יש לצבוע את התאים ב-500 מיקרוליטר של תמיסת חיץ מכתימה של אנקסין המכילה קלצאין, אתידיום הומדימר ואנקטין 5 למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
כוונן את המיקרוסקופ למדידת עוצמות באורכי גל עירור ופליטה של 630 ו-675 ננומטר עבור נספחים 5, 495 ו-515 ננומטר עבור calcein AM, ו-528 ו-617 ננומטר עבור צביעת אתידיום 1. לאחר מכן לרכוש תמונות של התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ה- iHCECs נמצאו כתאים קטנים בטווח של 10 עד 20 מיקרומטר וה- pHCECs היו בטווח של 20 עד 50 מיקרומטר לאחר 24 שעות של גידול.
הבדלים דומים בטווח הגדלים נצפו עבור iHCECs ו- pHCECs לאחר 48 שעות של צמיחה. בהשוואה לתאים שאינם חשופים לקרינת UV, הפעילות המטבולית של pHCECs מוקרנים הופחתה באופן משמעותי לאחר 20 דקות של חשיפה. עבור iHCECs, הפעילות המטבולית ירדה עבור תאים שהוקרנו הן 5 ו 20 דקות.
לכן, לקח זמן חשיפה ארוך יותר כדי להפחית את הפעילות המטבולית של pHCECs מאשר iHCECs. שחרור הציטוקינים המרבי על ידי iHCECs היה 5 דקות של חשיפה לקרינת UV. שחרור הציטוקינים המרבי עבור pHCECs התרחש לאחר 20 דקות של חשיפה לקרינת UV.
במונחים של הכמויות הכוללות של ציטוקינים דלקתיים ששוחררו, pHCECs שחררו הרבה יותר אינטרלוקין-1 בטא, אינטרלוקין 8 ו-TNF-אלפא מאשר iHCECs, ואילו iHCECs שחררו יותר אינטרלוקין 6. גם pHCECs וגם iHCECs הראו שינוי בשחרור אינטרלוקין 6 לאחר חשיפה לכל שלושת הכימיקלים. BAK גרם לירידה בשחרור אינטרלוקין 6 בהשוואה לביקורת עבור HCEC ראשוניים ומונצחים כאחד.
מי חמצן גרמו לעלייה בשחרור אינטרלוקין 6 מ- iHCECs, ולירידה בשחרור מ- pHCECs. גם pHCEC וגם iHCECs ניזוקו באופן משמעותי ב-0.005% וב-0.1% של BAK. לאחר ביצוע הערכות חוץ גופיות של רעילות תאי העין, ניתן לבצע מודלים נוספים של רעילות עינית בבעלי חיים כדי לקבוע את ההשפעה של מוצר עיני על עצבי הקרנית או על מערכת החיסון העינית.
טכניקות אלה חיוניות לקביעת המנגנונים של רעילות כימיקלים ופורמולציות מוצרים על העין ויסייעו למזער את השימוש בבעלי חיים לניסויים בפיתוח מוצרים.
