Этот метод может быть использован для оценки in vitro токсичности новых офтальмологических препаратов. Уточняя концентрации химических веществ и составов продуктов с использованием глазных клеток in vitro, можно свести к минимуму использование животных для оценки безопасности новых продуктов. Анализы in vitro оценивают конечные точки токсичности, которые не могут быть оценены in vivo, такие как определение влияния химического вещества на функцию митохондрий, целостность клеточной мембраны и активность ферментов.
Оценка клеточной токсичности in vitro является ключом к пониманию потенциальных механизмов токсичности. Это необходимо для установления максимально допустимой дозы терапевтических химических веществ в глазу. Продемонстрирует процедуру Ниджани Нагаарудкумаран, исследователь из лаборатории Джонса.
Начните с размещения как pHCEC, так и iHCEC на чашки Петри, покрытые коллагеновым покрытием, со стеклянной нижней крышкой в концентрации от 1 x 10 до 5-го с 1 миллилитром среды глазного эпителия человека или HOEM. Выращивайте pHCEC и iHCECs 1 набор культур в течение 24 часов и еще один набор в течение 48 часов в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. После инкубации окрашивают клетки 500 микролитрами буферного раствора для окрашивания аннексина, содержащего 4 микромолярного кальцеина, 8 микромолярных гомодимеров этидия 1 и аннексин 5, в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия.
После окрашивания клеток отрегулируйте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп для захвата длин волн возбуждения и излучения, как описано в текстовой рукописи. Получите двухмерные и трехмерные изображения, следуя инструкциям в рукописи. Засейте клетки в соотношении от 5 x 10 до 4-го на миллилитр HOEM в каждую лунку 24-луночной культуральной пластины, покрытой коллагеном 1, и инкубируйте при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение 3 часов.
После инкубации уменьшите объем среды в лунках до 300 микролитров. Затем подвергните клетки воздействию UVA-излучения при 6,48 Вт на квадратный метр и UVB-излучения при 1,82 Вт на квадратный метр при 37 градусах Цельсия в течение 5 и 20 минут в отдельных экспериментах. После УФ-излучения добавьте 200 микролитров свежего HOEM в каждую лунку и инкубируйте в течение 20 часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа.
На следующий день соберите надосадочную жидкость клетки в каждую лунку и переложите ее в стерильные полипропиленовые пробирки объемом 2 миллилитра. Заморозьте надосадочную жидкость при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы определить уровни цитокинов, высвобождаемых pHCEC и iHCEC после воздействия ультрафиолета, используйте мультиплексный анализ цитокинов и следуйте инструкциям набора для количественного определения интерлейкина 6, интерлейкина 8, интерлейкина-1 бета и TNF-альфа.
Приготовьте 10%-ный реагент метаболического анализа в DMEM и F12. Замените питательную среду в каждой лунке 1 миллилитром 10%-ного раствора для метаболического анализа и инкубируйте при 37 градусах Цельсия с 5%-ным углекислым газом в течение 4 часов. Измерьте флуоресценцию каждого раствора с помощью считывателя флуоресцентных пластин при возбуждении 530 нанометров и длине волны излучения 590 нанометров.
Семенные клетки в соотношении 5 x 10 до четверти на миллилитр HOEM в каждой лунке 24-луночной культуральной пластины, покрытой коллагеном 1. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа в течение 3 часов. После инкубации удалите среду и подвергните клетки воздействию 1 миллилитра химических токсинов, которые включают 0,001% хлорида бензалкония или BAK, 0,01% перекиси водорода и 0,0025% додецилсульфата натрия в PBS в течение 5 и 15 минут.
После воздействия химических токсинов удалите токсины из лунок, промойте 1 миллилитром PBS и добавьте 1 миллилитр HOEM в каждую лунку. После 20 часов инкубации проведите метаболический анализ, заменив среду 1 миллилитром 10%-ного раствора для метаболического анализа и инкубируя при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение 4 часов. Измерьте флуоресценцию каждого раствора с помощью считывателя флуоресцентных пластин при возбуждении 530 нм и длине волны излучения 590 нм.
Переложите надосадочные жидкости клеток из лунок после 20-часовой инкубации в отдельные стерильные полипропиленовые пробирки объемом 2 миллилитра и заморозьте их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Используйте ту же мультиплексную платформу, которая используется для оценки цитокинов из клеток, обработанных УФ-излучением, в соответствии с инструкциями набора для количественного определения интерлейкина 6, интерлейкина 8, интерлейкина-1 бета и ФНО-альфа. Затравочные клетки в концентрации от 1 x 10 до 5-го на миллилитр HOEM в каждой лунке 24-луночной культуральной пластины, покрытой коллагеном 1, и инкубируют при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение 24 часов.
После инкубации удалите среду и подвергните клетки воздействию 1 миллилитра химических токсинов, в том числе 0,001% BAK, 0,005% BAK и 0,01% BAK в PBS в течение 5 минут. После воздействия удалите химические токсины, промойте лунки 1 миллилитром PBS и добавьте по 1 миллилитру HOEM в каждую лунку. После 20 часов инкубации окрашивают клетки 500 микролитрами буферного раствора для окрашивания аннексина, содержащего кальцеин, гомодимер этидия и аннексин 5, в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия.
Настройте микроскоп для измерения интенсивности при длинах волн возбуждения и излучения 630 и 675 нанометров для аннексина 5, 495 и 515 нанометров для кальцеина AM и 528 и 617 нанометров для окрашивания этидием 1. Затем получают изображения клеток с помощью флуоресцентного микроскопа. Было обнаружено, что iHCEC представляют собой небольшие клетки размером от 10 до 20 микрометров, а pHCEC находятся в диапазоне от 20 до 50 микрометров после 24 часов роста.
Аналогичные различия в диапазоне размеров наблюдались для iHCEC и pHCEC после 48 часов роста. По сравнению с клетками, не подвергшимися воздействию ультрафиолета, метаболическая активность облученных pHCEC была значительно снижена через 20 минут воздействия. Для iHCEC метаболическая активность снижалась для клеток, облученных как через 5, так и через 20 минут.
Следовательно, для снижения метаболической активности pHCEC требовалось больше времени воздействия, чем iHCEC. Максимальное высвобождение цитокинов iHCEC было через 5 минут воздействия ультрафиолета. Максимальное высвобождение цитокинов для pHCEC происходило через 20 минут воздействия ультрафиолета.
С точки зрения общего количества высвобождаемых воспалительных цитокинов pHCEC высвобождают значительно больше интерлейкина-1 бета, интерлейкина 8 и TNF-альфа, чем iHCEC, тогда как iHCEC высвобождают больше интерлейкина 6. Как pHCEC, так и iHCEC показали изменение высвобождения интерлейкина 6 после воздействия всех трех химических веществ. БАК вызывал снижение высвобождения интерлейкина 6 по сравнению с контролем как для первичных, так и для иммортализированных ГХЕК.
Перекись водорода вызывала увеличение высвобождения интерлейкина 6 из iHCEC и снижение высвобождения из pHCEC. Как pHCEC, так и iHCEC были значительно повреждены при 0,005% и 0,1% BAK. После проведения in vitro оценки токсичности глазных клеток могут быть предприняты дальнейшие модели глазной токсичности на животных для определения влияния глазного продукта на нервы роговицы или иммунную систему глаза.
Эти методы необходимы для определения механизмов токсичности химических веществ и рецептур продуктов для глаз и помогут свести к минимуму использование животных для тестирования разработки продукта.
