Methanojenik Saf Kültürlerden ve Çevre örneklerinden Poliglutamat Kuyruk Uzunluğunun Analizi için Cofactor _F420 Ekstraksiyonu

Kofaktör F420, birçok prokaryotların birincil ve ikincil metabolizmasında önemli bir rol oynar. Bu molekülün çevresel örneklerde ölçülmesi, yaygınlığının ve işlevinin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Bu teknik, koktorun çamur ve toprak gibi zor numune malzemelerinde analizini sağlar.

Böylece malzemenin lizisi ve analizden önce ön saflaştırma merkezi adımlardır. Protokol, örnek hazırlama sırasında farklı adımlar içerir. Bu adımlar, numune işlemeye başlamadan önce çok iyi planlanmış ve hazırlanmalıdır.

Örneğin, taze tamponların hazırlanması önemlidir. Örnek lizise başlamak için, numunenin beş gramını 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Daha sonra numunelere beş mililitre 2X lizis tamponu ekleyin ve mililitre başına 0,5 gramlık son konsantrasyona ulaşmak için hacmi damıtılmış su ile 10 mililitreye getirin.

Seyreltilmiş örnekleri 20 saniye boyunca girdaplayın ve ardından 121 santigrat derecede 30 dakika boyunca otomatik olarak kaplayın. Orman toprağı gibi kuru numuneler için, otomatik kapanmadan sonra damıtılmış su ile 20 mililitrelik son hacme getirin ve seyreltilmiş numuneyi gösterildiği gibi 20 saniye boyunca tekrar girdaplayın. Numuneler soğuduktan sonra, numuneyi 11.000 x g'da beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı toplayın.

100 miligram zayıf anion karışık mod polimerik sorbent şartlandırma ile dolu beş mililitrelik katı faz ekstraksiyonu veya SPE sütunu hazırlayın. Daha sonra, anion eşanjörünü üç mililitre damıtılmış su ile dengelayın. Santrifüjlü lisattan spe sütununa dokuz mililitreye kadar süpernatan yükleyin.

Sütundaki safsızlıkları beş mililitre 25 milimolar amonyak asetat ve beş mililitre metanol ile ardışık olarak yıkayın. Yıkadıktan sonra, kofaktör F420'yi bir mililitre elution tamponu ile elüte edin. Fırını 40 santigrat dereceye ayarlayın ve floresan dedektörünü 420 nanometre yok olma dalga boylarına ve 470 nanometre emisyon dalga boylarına ayarlayın.

Ardından, 0,22 mikron gözenek boyutuna sahip bir PTFE filtresi kullanarak SPE'den elde edilen örneği HPLC şişelerine filtreleyin. Filtrelenmiş numunenin 50 mikrolitresini HPLC sistemine enjekte edin ve el yazmasında açıklandığı gibi mobil aşamaların bir kombinasyonunu kullanarak degrade modu ile kofaktör F420'yi ayırın. Cofactor F420 bileşimini ve konsantrasyonunu analiz edin.

Metanojenlerin saf kültürlerinin büyümesi mikroskopi ile doğrulandı. Faz kontrastlı mikroskopide, kofaktör F420 ultraviyole ışıkla heyecanlandığında mavimsi bir ışık yayan metanojenlerin aglomeraları görülebilir. Methanoculleus thermophilus kültürlerinin farklı hacimlerine sahip SPE'den sonra kurtarılan kofaktör F420'nin tepe alanı analiz edildi.

Otomatik kapanma parçalama stratejisi, basınç sıcaklığı tedavisi kullanarak maksimum ekstraksiyon verimliliğini sonuçlandırarak en yüksek tepe alanına ulaştı. Kuyruk uzunluğu dağılımının analizi, kofaktör F420'nin genel konsantrasyonundaki farklılıkları ve saf metanojenik kültürlerin F420 kuyruk uzunluğunun çevresel örneklerde dağılımını ortaya koydu. Bu yordamı uygularken, elution arabelleğinin toplam hacmini tamamen toplamayı veya akış hacmini tam olarak kaydetmeyi unutmayın.

Bu teknik, kofaktör F420'nin topraklar ve çamurlar gibi daha karmaşık örneklerde araştırılmasının önünü açmakta ve bu molekülün ekolojik etkisi hakkında daha derin içgörüler sağlamaktadır.