Bu prosedürün amacı mikrotübül organizasyonuni ve dinamiklerini değerlendirmektir. Nöronlar, alttaki sitoskeletonları tarafından tutulan farklı aksonal, dendritik ve sinaptik bölmelere sahip polarize hücrelerdir. Mikrotübüller nöronal sitoskeletonun çoğunluğunu oluşturur ve nöronal gelişim ve olgunlaşma sırasındaki önemli olayları dinamikler ve yönelim belirler.
Mikrotübüller alfa ve beta tübulin heterodimerlerinden oluşur ve doğası gereği son derece dinamik artı uçlar ve kararlı eksi uçlarla polarize edilir. Artı uçlarda polimerizasyon sırasında, son bağlayıcı proteinlerin çok molekülerli bir kompleksi, geçici olarak protofilamentlerle ilişkilendirir ve tübulin dimerlerinin montajını teşvik eder. Bu teknik, in vivo sinir mikrotübüllerini görselleştirmemize yardımcı olacaktır.
Bu tekniği kullanarak, C.elegans nöronunun gelişimi ve yenilenmesi sırasında dinamik mikrotübüllerin yönelimini ve diğer parametrelerini belirleyebilirsiniz. Bu muhabiri genellikle duyusal nörondaki mikrotübül dinamiklerini görselleştirmek için kullanırız. Ancak bu hücrelerdeki dinamik mikrotübülleri görselleştirmek için bu muhabiri kas ve cilt gibi diğer hücre tiplerinde ifade edilebilir.
Burada EBP'den GFP'ye kadar floresan etiketli son bağlayıcı proteinler kuyruklu yıldız olarak görünür. Bu kuyrukluyıldızların dinamikleri, mikrotübüllerin birlikte büyümesi ve mikrotübül dinamiklerini ve yönelimini ölçmek için önemli bir gösterge ile ilişkilendirilmiştir. Bu kuyrukluyıldızları belirli bir hücre tipinde gözlemlemek için, EBP-2 ve GFP DNA'sı olan transgene belirli bir promotör altında ifade edilir.
PLM nöronlarında ifade için, bu transgene promotör için make altında ifade edilir. Bu transgenik solucanlar, sıralama veya montajdan önce floresan ayarlanmış bir stereo mikroskop altında görüntülenebilir. EBP kuyruklu yıldızlarını görüntülemek için solucanları monte etmek için M9 tamponunda%10 Argos yapıyoruz.
ve cam bir kaydırağın üzerine bir damla yerleştirin. Başka bir slayt, damlayı bir ped içine katılaştıran bir filme bastırmak için kullanılır. Montaj ortamı olarak 0,1 mikron, polistiren boncuk kullanıyoruz, boncuk çözeltisinde birkaç solucan toplanıyor ve yeniden askıya alınıyor.
Solucanları hareketsiz hale getirmek için bir kapak kayması avlanır ve görüntüleme için alınır. Monte edilenler, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için bir kamera ile herhangi bir floresan mikroskopta görüntülenebilir. Kurulum, daha hızlı bir alım ve daha az fotoğraf ağartma ve fotoğraf toksisitesi için bir dönen disk ünitesi ile donatılmıştır.
Slayt sahnede tutulur ve solucan alanı parlak alan aydınlatması kullanılarak odaklanır ve ortalanır. Bu amaçla 5X veya 10X gibi düşük büyütme hedefi kullanılabilir. Solucanlar, aynı aydınlatma kullanılarak 63X gibi yüksek büyütme hedefine yeniden odaklanabilir.
Bu amaç kuyrukluyıldızların görüntülenmesi için optimum bir mekansal çözünürlük sağlar. Plm nöronunun sabit bir merkezileştirme, gereksiz ışık maruziyetini ve budamanın fotoğraf ağartmasını önlemek için floresan aydınlatması altında yapılır. Görüntü alımı için site dışına yazılım gönder'i kullanıyoruz.
Brightfield kanalında canlı görüntüleme konfigürasyonunun kullanılmasıyla solucanın kuyruk bölgesini odaklayıp görüş alanına ortalıyoruz. Bunu, 488 nanometre ekscitasyon ışığı ile ışık görüntüleme konfigürasyonu kullanılarak PNM nöronunun odaklanması takip eder. Zaman atlamalı bir alım için, pozlama süresinin, zaman atlama süresinin ve çerçeveler arasındaki aralığın görüntülemenin zamansal becerilerini tanımladığı deneysel bir ayar oluşturulur.
Nicel ölçümler için EBP kuyruklu yıldızlarının bazı filmleri açık kaynaklı bir yazılım olan Image J'de analiz edilmelidir. Edinilen zaman atlamalı, film olarak önizlenebilen çok görüntülü bir iplikçik olarak açılır. Bu özel zaman atlamalıda, PLM nöronunun hücre gövdesinde, ön ve arka sürecinde kuyruklu yıldızlar görülebilir.
Hücre gövdesinden uzaklaşan kuyruklu yıldızlar artı-uç, hücre vücuduna doğru hareket edenler ise eksi-uç-out olarak sınıflandırılır. Analize başlamak için, bu durumda PLM nöronunun iç süreci olan ilgi alanı üzerinde parçalı bir çizgi çizilir. Bu çizgi parçası, görüntülerin yeniden kayma işlevi kullanılarak kimografa dönüştürülür.
Kimograf, hareketli kuyrukluyıldızları temsil eden çapraz kırışıklıklarla uzak bir zaman görüntüsüdür. Bu izler üzerine düz çizgi parçaları çizilebilir ve analiz menüsü kullanılarak ölçüm parametreleri ayarlanabilir. Bu parametreler, Excel gibi veri çözümleme programında standart ölçülebilir miktarlara ve birimlere dönüştürülebilir.
İzlemenin genişliği büyüme uzunluğuna karşılık gelir. Hight büyüme süresini temsil eder ve kırışık açısı kuyrukluyıldızların yönünü verir. Bu kuyruklu yıldızlar, mikrotübüllerin göreceli yönelimini bulmak için artı-son ve eksi-sonu olarak sınıflandırılabilir.
EBTA GFP'nin transgenik ekspresyasyonu, mikrotübül dinamiklerini yeni yenilenme gibi çeşitli hücresel bağlamda gözlemlemek için uyarlanabilir. Bölge derecelendirme aksonlarındaki mikrotübül dinamiklerini gözlemlemek için, akson, büyük ikincil hasara neden olmadan aksonu tam olarak kesebilen bir femtosaniye lazer kullanılarak yaralanır. Yaralanmadan sonra, solucanlar daha sonraki gözlemler için tohumlu motor plakalarına geri kazanılabilir.
PLM nöronları, yaralanmadan altı saat sonra gözlemlenebilen sağlam eksoneree rejenerasyonu gösterir. Fototoksisitenin yeni hakları yenilemesini önlemek için, canlı görüntüleme dönen bir disk mikroskobunda gerçekleştirilir. Yenileyen aksonların zaman atlamalı alımları daha sonra kuyrukluyıldızların analizi için kymograflara dönüştürülebilir.
Kuyrukluyıldızların mesafe süresi ve yönü daha sonra mikrotübül yönelimi ve dinamikleri açısından yorumlanabilir. Eleştirel yönelimim ve dinamiklerim, hücre bölünmesi, hücresel mimarinin geçişi ve bakımı gibi sivil hücresel süreçlerin temel belirleyicileridir. Mikrotübül dinamiklerinin ölçümü için birçok araç mevcut olsa da, in vivo ölçüm zor olabilir.
Otoflorescence, fotoğraf toksisitesi, aşırı ekspresyon objesi ve değişken bildirilen yoğunluklar, mikrotübül dinamiklerini değerlendirmek için son bağlayıcı proteinlerin canlı gözlemi sırasında karşılaşılan zorluklardan bazılarıdır. Bu çalışma, sınır dışı edilmiş DNA ve düşük aydınlatma görüntüleme konsantrasyonuna sahip entegre bir transgenik kullanarak, bu zorlukların bazılarını azaltmak için yöntemleri ele almıştır. Burada açıklanan görüntüleme ve analiz modülleri diğer mikrotübül bazlı muhabirlere ve protein taşımacılığına doğru genişletilebilir.
Bu sadece C.elegance nöronları için geçerli değildir, aynı zamanda diğer hücre tiplerine ve model sistemlerine de uygulanabilir.
