Kötü huylu glioma hücreleri ve çevresindeki nöronlar arasındaki etkileşimler ilgi görüyor. Burada, türetilmiş kortikal glutamaterjik nöronları ve tümör hücrelerini birlikte kültleyen bir in vitro modelin gelişimini gösteriyoruz. Çokelektod dizileri ile birleştirilmiş ortak kültürler için kullanılan mikroakışkan cihazlar, farklı hücre türlerinin incelenmesine ve kültürlerin farklı zaman noktalarında elektriksel aktivite kayıtlarının yapılmasına izin verir.
Bu yöntem özellikle fonksiyonel ve mekanistik çalışmalar ve pediatrik yüksek dereceli glioma hücre göçini ve nöronlarla etkileşimi engelleyen farmakolojik ajanların etkilerini analiz etmek için yararlıdır. Ticarileştirilmiş insan IPS türevi kortikal glutamaterjik nöronları kültleştirmeye başlamak için, mikroakışkan cihazın giriş ve çıkış rezervuarlarını pipet aspirasyonu ile boşaltın, sadece cihaz kanallarının ortamla doldurulmasına izin vermek. Ortama mililitre süspansiyon başına 6,5 milyon insan IPS hücresinden oluşan 10 mikrolitre ekleyerek insan IPS hücrelerini tohumlayın ve hücrelerin bağlanmasına izin vermek için cihazın 15 dakika boyunca kaputun altında olmasını bekleyin.
15 dakika sonra, hem giriş hem de çıkış rezervuarlarını 50 mikrolitrelik dördüncü kültür ortamıyla doldurun, ardından hücreleri 37 santigrat derecede ve 23 gün boyunca% 5 karbondioksitte tutmak için cihazı inkübatöre aktarın. Ortamı metinde açıklandığı gibi her üç ila dört günde bir değiştirin. Hücreleri saymak ve standart faz kontrast mikroskobu kullanarak canlılığı değerlendirmek için 4.
DMEM ve F-12 GlutaMAX'ta hem UW479 hem de BT35 hücre hatlarının kültürü, hücre kültürü şişesinde% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiştir. Deney boyunca normoksik koşullarda hücre kültürünü 37 santigrat derecede kontrollü bir ortamda koruyun. %80 izdiah süresine ulaşmak için her hücre hattını gözlemleyin.
Glutamaterjik nöronların kültür sonrası 21. gününde UW479 ve BT35 hücrelerini deneyerek ortak kültüre başlayın. Trypsined UW479 ve BT35 hücrelerini her özel mikroakışkan cihazda olgun yapışkan glutamaterjik nöronların üzerine tohumleyin. Glutamaterjik nöron D11 ve ileri orta ile 37 santigrat derecede kontrollü bir ortamda ve% 5 karbondioksit altında iki gün boyunca ortak kültürleri koruyun.
Canlılıklarını değerlendirmek ve hücrelerin yüzdesini hesaplamak için görüntü analiz yazılımı ile analiz edilen mikroskobik resimleri kullanarak pediatrik yüksek dereceli glioma hücrelerini sayın. MFD'yi kayıt cihazına yerleştirin ve glutamaterjik nöronların elektrofizyolojik kaydını 21. Pediatrik yüksek dereceli glioma hücrelerini tohumlamadan önce, ko-kültüre paralel kontrol olarak kültürlenmiş farklılaştırılmış glutamaterjik nöronların ikinci bir elektrofizyolojik kaydını gerçekleştirin.
İki günlük ortak kültürden sonra 23. İnsan IPS türevi kortikal glutamaterjik nöronlar nestin, SOX2, metabotropik glutamat reseptörleri II ve VGLUT1 immünostaining kullanılarak karakterize edildi ve değerlendirildi. Nestin bir ara filament proteinidir ve farklılaşmamış CNS hücrelerinde ifade edildi.
SOX2 ayrıca CNS'deki nöral epitelinin farklılaşmamış hücrelerinde de ifade edildi. Nestin ve SOX2 pozitif hücre yüzdesi dördüncü günden 21. güne kadar azalarak glutamaterjik nöronların farklılaşmış durumunu doğruladı. Mikroskobik görüntüler, glutamaterjik nöronların mikroakışkan cihazlar arasında ilerleyici bir dağılımını ortaya çıkardı.
Kültüre BT35 ve UW479 eklendiğinde, yüzen hücrelerin 21. günde glioma hücre tohumlamasının ardından mevcut olduğu, 23. güne kadar giderek kaybolduğu ve cihazda yapıştığı gözlendi. BT35 ve UW479 için uygulanabilir hücrelerin yüzdeleri karşılaştırılabilir ve hasta kaynaklı hücre çizgilerinin uygun şekilde kullanılabileceğini ima etti. Kültürün 23.
Sinir ağı aktivitesinin eşzamanlılığını izlemek için BT35 veya glutamaterjik nöronlardaki anlık atış hızı kaydedildi. Bireysel kültürlü ve birlikte kültürlü glutamaterjik nöronlar arasındaki elektriksel aktivite farkı 23. Daha fazla metodolojik gelişim, patlama analizi ve ağın özel zamansal çapraz korelasyonları ile ağın fonksiyonel değerlendirmesini içerebilir.
Şimdi, araştırmacılar pediatrik yüksek dereceli glioma tümör hatlarının ve yüksek PSC nöronlarının etkileşimlerini ve farmakolojik hedeflemesini araştırmak için umut verici bir araca sahipler. Çeşitli tümör çizgileri ve çeşitli nöron tipleri kullanılabilir.
