글루타미터기뉴런과 소아 고학년 신경교세포의 공동 배양을 미세유체 장치로 결합하여 전기 적 상호 작용을 평가합니다.

악성 신경 종 세포와 그들의 주변 신경 사이 상호 작용 관심을 얻고 있다. 여기서, 우리는 유래 된 피질 글루타머기 뉴런 및 종양 세포를 공동 배양하는 체외 모델의 발달을 보여줍니다. 다중 전극 어레이에 결합된 공동 배양에 사용되는 마이크로플루딕 장치는 다양한 세포 유형의 연구를 허용하고 배양의 다른 시점에서 전기 활동 기록을 수행할 수 있습니다.

이 방법은 기능및 기계학 연구 와 소아 고급 신경교종 세포 이동 및 뉴런과의 상호 작용을 차단하는 약리학 에이전트의 효과를 분석하는 데 특히 도움이됩니다. 상용화된 인간 IPS 유래 피질 글루타마테기닉 뉴런을 배양하기 시작하려면, 파이펫 포부에 의해 미세유체 장치의 입구 및 출구 저장소를 비우고 장치 채널만 매체로 채워지게 한다. 인간 IPS 세포를 배지에 밀리리터 서스펜션당 650만 개의 인간 IPS 세포의 10마이크로리터를 첨가하고 세포가 부착할 수 있도록 15분 동안 후드 아래에 장치가 있게 하였다.

15분 후, 4일 배양 배지의 50마이크로리터로 입구와 출구 저장소를 모두 채운 다음, 23일 동안 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지하기 위해 인큐베이터로 장치를 옮기다. 텍스트에 설명된 대로 3~4일마다 미디어를 교체합니다. 세포를 계산하고 표준 상 대비 현미경을 사용하여 생존가능성을 평가하기 위해 4일, 21일 및 23일에 현미경 사진을 찍습니다.

DMEM과 F-12 글루타맥스의 UW479 및 BT35 세포주 모두 세포 배양플라스크에서 10%의 태아 소 혈청을 보충하였다. 실험 전반에 걸쳐 노목상 조건에서 섭씨 37도에서 조절된 환경에서 세포 배양을 유지한다. 80%의 합류에 도달하기 위하여 각 세포줄을 관찰하십시오.

21일째에 글루타머틱 뉴런의 배양 후, UW479 및 BT35 세포를 트립시닉하여 공동 배양을 시작합니다. 각 전용 미세 유체 장치에서 성숙한 부착 글루타마테기뉴런 위에 트립시화 된 UW479 및 BT35 세포를 시드하십시오. 대조환경하에서 2일 동안 공동배양을 섭씨 37도, 글루타미터기칼 뉴런 D11및 이후 배지로 이산화탄소 5%로 유지한다.

소아 고급 신경종 세포를 이미지 분석 소프트웨어로 분석하여 분석한 현미경 사진을 사용하여 생존가능성을 평가하고 세포의 백분율을 계산합니다. MFD를 기록 장치에 배치하고 21일에 글루타미테르기뉴런의 전기생리학적 기록을 수행하기 위해 시판되는 소프트웨어를 사용합니다. 소아 고급 신경교종 세포를 종자하기 전에, 공동 배양에 평행하게 대조군으로 배양된 분화 된 글루타머기 뉴런의 제2 전기 생리학적 기록을 수행한다.

공동 배양 이틀 후 인 23 일에 또 다른 전기 생리학적 기록을 수행하십시오. 인간 IPS 유래 피질 글루타마테기크 뉴런은 네스티닌, SOX2, 대사트로픽 글루타민산 수용체 II 및 VGLUT1 면역스테인링을 사용하여 특징화되고 평가되었다. 네신은 중간 필라멘트 단백질이며 미분화 된 CNS 세포로 발현되었습니다.

SOX2는 또한 CNS에서 신경 상피의 미분화 세포에서 발현되었다. 네스틴과 SOX2 양성 세포 비율은 4일째부터 21일까지 감소하여 글루타미터기뉴런의 분화 상태를 확인하였다. 현미경 이미지는 미세 유체 장치에 걸쳐 글루타머기 뉴런의 점진적 분포를 밝혔다.

BT35와 UW479가 배양물에 첨가되었을 때, 21일째에 신경교종 세포 파종 후 부동 세포가 존재하여 23일까지 점진적으로 사라지고 장치에 부착된 것으로 관찰되었다. BT35 및 UW479에 대한 실행 가능한 세포의 백분율은 환자 유래 세포주를 적절히 사용할 수 있다는 것을 비교하고 암시했습니다. 배양 23일째에 스파이크 검출 및 래스터 플롯은 소아 고급 신경교종 세포를 첨가한 후 전기 활동이 증가하는 것으로 나타났다.

신경망 활동의 동시성을 모니터링하기 위해 BT35 또는 글루타마테르기크 뉴런의 즉각적인 발사 속도가 기록되었습니다. 개별적으로 배양된 글루타미터기뉴런과 공동 배양된 글루타미터기뉴런 간의 전기활동의 차이는 23일째에 유의했다. 추가 방법론적 개발은 네트워크의 버스트 분석 및 특별한 시간적 교차 상관관계를 가진 네트워크의 기능적 평가를 포함할 수 있다.

지금, 연구원은 소아 고급 신경교종 종양 선 및 높은 PSC 뉴런의 상호 작용 및 약리학적 표적을 탐구하는 유망한 공구가 있습니다. 몇몇 종양 선 및 몇몇 신경 모형은 이용될 수 있습니다.