Le interazioni tra le cellule di glioma maligno e i neuroni circostanti stanno guadagnando interesse. Qui, mostriamo lo sviluppo di un modello in vitro che co-coltiva neuroni glutamatergici corticali derivati e cellule tumorali. I dispositivi microfludici utilizzati per le co-colture accoppiate a array multielettrodi consentono lo studio di diversi tipi di cellule ed eseguono registrazioni di attività elettrica in diversi punti temporali delle colture.
Questo metodo è particolarmente utile per studi funzionali e meccanicistici e per analizzare gli effetti degli agenti farmacologici che bloccano la migrazione delle cellule di glioma pediatrico di alto grado e l'interazione con i neuroni. Per iniziare a coltivare i neuroni glutamatergici corticali derivati dall'IPS umano commercializzati, svuotare i serbatoi di ingresso e di uscita del dispositivo microfluidico mediante aspirazione a pipetta, lasciando che solo i canali del dispositivo siano riempiti con il mezzo. Semina le cellule IPS umane aggiungendo 10 microlitri di 6,5 milioni di cellule IPS umane per millilitro di sospensione nel mezzo e lascia che il dispositivo sia sotto il cofano per 15 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi.
Dopo 15 minuti, riempire sia i serbatoi di ingresso che di uscita con 50 microlitri del quarto giorno di terreno di coltura, quindi trasferire il dispositivo nell'incubatore per mantenere le celle a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 23 giorni. Sostituire il mezzo ogni tre o quattro giorni come descritto nel testo. Per contare le cellule e valutare la vitalità utilizzando un microscopio a contrasto di fase standard, scattare foto microscopiche al 4 ° giorno, 21 ° giorno e 23 ° giorno.
Coltura di entrambe le linee cellulari UW479 e BT35 in DMEM e F-12 GlutaMAX integrate con siero bovino fetale al 10% in un pallone di coltura cellulare. Mantenere la coltura cellulare in un ambiente controllato a 37 gradi Celsius in condizioni normossiche durante l'esperimento. Osservare ogni linea cellulare per raggiungere l'80% di confluenza.
Il giorno 21 post-coltura dei neuroni glutamatergici, iniziare la co-coltura tripsinificando le cellule UW479 e BT35. Semina le cellule UW479 e BT35 tripsinizzate sopra i neuroni glutammatergici aderenti maturi in ciascun dispositivo microfluidico dedicato. Mantenere le co-colture per due giorni in un ambiente controllato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con neurone glutamatergico D11 e mezzo successivo.
Conta le cellule di glioma pediatrico di alto grado utilizzando le immagini microscopiche analizzate con il software di analisi delle immagini per valutare la loro vitalità e calcolare la percentuale di cellule. Posizionare l'MFD nel dispositivo di registrazione e utilizzare un software disponibile in commercio per eseguire la registrazione elettrofisiologica dei neuroni glutammatergici il 21 ° giorno. Prima di seminare cellule di glioma pediatrico di alto grado, eseguire una seconda registrazione elettrofisiologica dei neuroni glutamatergici differenziati coltivati come controllo parallelo alla co-coltura.
Eseguire un'altra registrazione elettrofisiologica il 23 ° giorno dopo due giorni di co-coltura. I neuroni glutamatergici corticali derivati dall'IPS umano sono stati caratterizzati e valutati utilizzando nestin, SOX2, recettori metabotropici del glutammato II e immunocolorazione VGLUT1. La nestin è una proteina del filamento intermedio ed è stata espressa in cellule indifferenziate del SNC.
SOX2 è stato anche espresso in cellule indifferenziate dell'epitelio neurale nel SNC. La percentuale di cellule nestine e SOX2-positive è diminuita dal quarto giorno al 21 ° giorno, confermando lo stato differenziato dei neuroni glutamatergici. Le immagini microscopiche hanno rivelato una distribuzione progressiva dei neuroni glutamatergici attraverso dispositivi microfluidici.
Quando BT35 e UW479 sono stati aggiunti alla coltura, è stato osservato che le cellule galleggianti erano presenti dopo la semina delle cellule di glioma il 21 ° giorno, che è progressivamente scomparsa fino al 23 ° giorno e sono diventate aderenti al dispositivo. Le percentuali di cellule vitali per BT35 e UW479 erano comparabili e implicavano che le linee cellulari derivate dal paziente potessero essere utilizzate in modo appropriato. Il rilevamento di picchi e il grafico raster il 23 ° giorno di coltura hanno mostrato un aumento dell'attività elettrica dopo l'aggiunta di cellule di glioma pediatrico di alto grado.
Per monitorare la sincronicità dell'attività della rete neurale, è stata registrata la velocità di attivazione istantanea nei neuroni BT35 o glutamatergici. La differenza nell'attività elettrica tra i neuroni glutamatergici coltivati individualmente e co-coltivati è stata significativa il 23 ° giorno. Ulteriori sviluppi metodologici possono includere la valutazione funzionale della rete con analisi burst e speciali correlazioni temporali incrociate della rete.
Ora, i ricercatori hanno uno strumento promettente per esplorare le interazioni e il targeting farmacologico delle linee tumorali del glioma pediatrico di alto grado e dei neuroni ad alto PSC. Potrebbero essere utilizzate diverse linee tumorali e diversi tipi di neuroni.
