Las interacciones entre las células de glioma maligno y sus neuronas circundantes están ganando interés. Aquí, mostramos el desarrollo de un modelo in vitro de co-cultivo derivado de neuronas glutamatérgicas corticales y células tumorales. Los dispositivos microfluidos utilizados para los cocultivos acoplados a matrices multielectrodos permiten el estudio de diferentes tipos de células y realizan registros de actividad eléctrica en diferentes puntos temporales de los cultivos.
Este método es particularmente útil para estudios funcionales y mecanicistas y para analizar los efectos de los agentes farmacológicos que bloquean la migración celular pediátrica de glioma de alto grado y la interacción con las neuronas. Para comenzar a cultivar las neuronas glutamatérgicas corticales humanas derivadas de IPS comercializadas, vacíe los depósitos de entrada y salida del dispositivo microfluídico mediante aspiración de pipeta, dejando que solo los canales del dispositivo se llenen con medio. Sembra las células IPS humanas agregando 10 microlitros de 6.5 millones de células IPS humanas por mililitro de suspensión en el medio y deja que el dispositivo esté debajo del capó durante 15 minutos para permitir que las células se adhieran.
Después de 15 minutos, llene los depósitos de entrada y salida con 50 microlitros de medio de cultivo del cuarto día, luego transfiera el dispositivo a la incubadora para mantener las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 23 días. Reemplace el medio cada tres o cuatro días como se describe en el texto. Para contar las células y evaluar la viabilidad utilizando un microscopio de contraste de fase estándar, tome imágenes microscópicas en el día 4, el día 21 y el día 23.
Cultivo de líneas celulares UW479 y BT35 en DMEM y F-12 GlutaMAX suplementado con suero bovino fetal al 10% en un matraz de cultivo celular. Mantener el cultivo celular bajo un ambiente controlado a 37 grados centígrados en condiciones normóxicas durante todo el experimento. Observe cada línea celular para alcanzar el 80% de confluencia.
El día 21 post-cultivo de neuronas glutamatérgicas, comience el co-cultivo mediante la tripsinización de las células UW479 y BT35. Sembra las células tripsinizadas UW479 y BT35 sobre las neuronas glutamatérgicas adherentes maduras en cada dispositivo microfluídico dedicado. Mantener los cocultivos durante dos días bajo un ambiente controlado a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con neurona glutamatérgica D11 y medio en adelante.
Contar las células de glioma pediátrico de alto grado utilizando las imágenes microscópicas analizadas con el software de análisis de imágenes para evaluar su viabilidad y calcular el porcentaje de células. Coloque el MFD en el dispositivo de grabación y utilice un software disponible comercialmente para realizar el registro electrofisiológico de las neuronas glutamatérgicas el día 21. Antes de sembrar células de glioma pediátrico de alto grado, realizar un segundo registro electrofisiológico de las neuronas glutamatérgicas diferenciadas cultivadas como control paralelo al cocultivo.
Realizar otro registro electrofisiológico el día 23 después de dos días del cocultivo. Las neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de IPS humanas se caracterizaron y evaluaron utilizando nestina, SOX2, receptores metabotrópicos de glutamato II e inmunotinción VGLUT1. La nestina es una proteína de filamento intermedio y se expresó en células indiferenciadas del SNC.
SOX2 también se expresó en células indiferenciadas del epitelio neural en el SNC. El porcentaje de células nestinas y SOX2 positivas disminuyó desde el cuarto día hasta el día 21, confirmando el estado diferenciado de las neuronas glutamatérgicas. Las imágenes microscópicas revelaron una distribución progresiva de las neuronas glutamatérgicas a través de dispositivos microfluídicos.
Cuando se agregaron BT35 y UW479 al cultivo, se observó que las células flotantes estaban presentes después de la siembra de células de glioma en el día 21, que desapareció progresivamente hasta el día 23 y se hizo adherente en el dispositivo. Los porcentajes de células viables para BT35 y UW479 eran comparables e implicaban que las líneas celulares derivadas del paciente podían usarse adecuadamente. La detección de picos y el diagrama ráster en el día 23 de cultivo mostraron un aumento de la actividad eléctrica después de agregar células de glioma pediátrico de alto grado.
Para monitorear la sincronicidad de la actividad de la red neuronal, se registró la velocidad de disparo instantáneo en BT35 o neuronas glutamatérgicas. La diferencia en la actividad eléctrica entre las neuronas glutamatérgicas cultivadas individualmente y cocultivadas fue significativa en el día 23. El desarrollo metodológico adicional puede incluir la evaluación funcional de la red con análisis de ráfagas y correlaciones cruzadas temporales especiales de la red.
Ahora, los investigadores tienen una herramienta prometedora para explorar las interacciones y la orientación farmacológica de las líneas tumorales pediátricas de glioma de alto grado y las neuronas PSC altas. Se pueden usar varias líneas tumorales y varios tipos de neuronas.
