Взаимодействие между клетками злокачественной глиомы и окружающими их нейронами набирает интерес. Здесь мы показываем разработку модели in vitro совместного культивирования корковых глутаматергических нейронов и опухолевых клеток. Микрофлюдические устройства, используемые для кокультур, связанных с многоэлектродными массивами, позволяют изучать различные типы клеток и выполнять записи электрической активности в разные моменты времени культур.
Этот метод особенно полезен для функциональных и механистических исследований и для анализа эффектов фармакологических агентов, которые блокируют детскую миграцию клеток глиомы высокой степени и взаимодействие с нейронами. Чтобы начать культивирование коммерциализированных кортикальных глутаматергических нейронов, полученных из IPS человека, опорожняйте входные и выходные резервуары микрофлюидного устройства с помощью аспирации пипетки, позволяя только каналам устройства быть заполненными средой. Засейте человеческие IPS-клетки, добавив 10 микролитров из 6,5 миллионов человеческих IPS-клеток на миллилитр суспензии в среде и позвольте устройству находиться под капотом в течение 15 минут, чтобы позволить клеткам прикрепиться.
Через 15 минут заполните как впускные, так и выходные резервуары 50 микролитрами питательной среды четвертого дня, затем переместите устройство в инкубатор для поддержания клеток при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 23 дней. Заменяйте носитель каждые три-четыре дня, как описано в тексте. Чтобы подсчитать клетки и оценить жизнеспособность с помощью стандартного фазового контрастного микроскопа, сделайте микроскопические снимки на 4-й день, 21-й день и 23-й день.
Культивируйте клеточные линии UW479 и BT35 в DMEM и F-12 GlutaMAX с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки в колбе для клеточной культуры. Поддерживайте культуру клеток в контролируемой среде при 37 градусах Цельсия в нормоксических условиях на протяжении всего эксперимента. Наблюдайте за каждой клеточной линией, чтобы достичь 80% слияния.
На 21-й день после культивирования глутаматергических нейронов начните совместную культуру, трипсинизируя клетки UW479 и BT35. Посейте трипсинизированные клетки UW479 и BT35 поверх зрелых адгезивных глутаматергических нейронов в каждом выделенном микрофлюидном устройстве. Поддерживайте кокультуры в течение двух дней в контролируемой среде при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа с глутаматергическим нейроном D11 и далее средой.
Подсчитайте педиатрические клетки глиомы высокой степени с помощью микроскопических изображений, проанализированных с помощью программного обеспечения для анализа изображений, чтобы оценить их жизнеспособность и рассчитать процент клеток. Поместите МФД в записывающее устройство и используйте коммерчески доступное программное обеспечение для выполнения электрофизиологической записи глутаматергических нейронов на 21-й день. Перед посевом педиатрических полноценных клеток глиомы выполните вторую электрофизиологическую запись дифференцированных глутаматергических нейронов, культивируемых в качестве контроля параллельно кокультуре.
Выполните еще одну электрофизиологическую запись на 23-й день после двух дней совместной культуры. Кортикальные глутаматергические нейроны человека, полученные из IPS, были охарактеризованы и оценены с использованием нестина, SOX2, метаботропных глутаматных рецепторов II и иммуноокрашивания VGLUT1. Нестин является промежуточным нитевидным белком и экспрессировался в недифференцированных клетках ЦНС.
SOX2 также экспрессировался в недифференцированных клетках нервного эпителия в ЦНС. Процент нестина и SOX2-положительных клеток снижался с четвертого дня до 21-го дня, подтверждая дифференцированное состояние глутаматергических нейронов. Микроскопические изображения показали прогрессивное распределение глутаматергических нейронов по микрофлюидным устройствам.
Когда BT35 и UW479 были добавлены в культуру, было замечено, что плавающие клетки присутствовали после посева клеток глиомы на 21-й день, которые постепенно исчезали до 23-го дня и становились адгезивными в устройстве. Процентное содержание жизнеспособных клеток для BT35 и UW479 было сопоставимым и подразумевало, что клеточные линии, полученные от пациента, могут быть использованы надлежащим образом. Обнаружение шипов и растровый график на 23-й день культивирования показали повышенную электрическую активность после добавления педиатрических полноценных клеток глиомы.
Для мониторинга синхронности активности нейронной сети регистрировали мгновенную скорость срабатывания в BT35 или глутаматергических нейронах. Разница в электрической активности между индивидуально культивируемыми и совместно культивируемыми глутаматергическими нейронами была значительной на 23-й день. Дальнейшая методологическая разработка может включать функциональную оценку сети с пакетным анализом и специальными временными перекрестными корреляциями сети.
Теперь у исследователей есть многообещающий инструмент для изучения взаимодействий и фармакологического таргетинга педиатрических линий опухоли глиомы высокой степени и нейронов с высоким PSC. Может быть использовано несколько опухолевых линий и несколько типов нейронов.
