将谷氨酸能神经元和儿科高级别胶质瘤细胞共培养到微流体装置中以评估电相互作用

恶性胶质瘤细胞与其周围神经元之间的相互作用越来越受到关注。在这里，我们展示了一种体外模型的发展，该模型共培养衍生的皮质谷氨酸能神经元和肿瘤细胞。用于共培养的微流体装置与多电极阵列耦合，允许研究不同的细胞类型，并在培养物的不同时间点进行电活动记录。

该方法对于功能和机制研究以及分析阻断儿科高级别胶质瘤细胞迁移和与神经元相互作用的药理药物的作用特别有用。为了开始培养商业化的人IPS衍生的皮质谷氨酸能神经元，通过移液器抽吸清微流体装置的入口和出口储库，只让装置通道充满培养基。通过在培养基中每毫升悬浮液添加10微升650万人IPS细胞来播种人IPS细胞，并让设备在引擎盖下放置15分钟以允许细胞附着。

15分钟后，用50微升的第四天培养基填充入口和出口储液槽，然后将设备转移到培养箱中，将细胞保持在37摄氏度和5%二氧化碳23天。如文中所述，每三到四天更换一次介质。要使用标准相差显微镜对细胞进行计数并评估活力，请在第4天，第21天和第23天拍摄显微镜照片。

在DMEM和F-12 GlutaMAX中培养UW479和BT35细胞系，并在细胞培养瓶中补充10%胎牛血清。在整个实验过程中，在37摄氏度的受控环境中，在正常氧条件下保持细胞培养。观察每个细胞系以达到80%的汇合度。

在谷氨酸能神经元培养后的第21天，通过胰蛋白酶消化UW479和BT35细胞开始共培养。将胰蛋白酶消化的UW479和BT35细胞接种在每个专用微流体装置中成熟贴壁谷氨酸能神经元的顶部。在37摄氏度和5%二氧化碳的受控环境中，用谷氨酸能神经元D11和更高培养基保持共培养物两天。

使用图像分析软件分析的显微图片对儿科高级别胶质瘤细胞进行计数，以评估其活力并计算细胞百分比。将MFD放在记录设备中，并使用市售软件在第21天对谷氨酸能神经元进行电生理记录。在接种儿科高级别胶质瘤细胞之前，对作为与共培养平行培养的对照培养的分化谷氨酸能神经元进行第二次电生理记录。

在共培养两天后的第23天进行另一次电生理记录。使用巢蛋白、SOX2、代谢性谷氨酸受体II和VGLUT1免疫染色对人IPS衍生的皮质谷氨酸能神经元进行了表征和评估。巢蛋白是一种中间丝蛋白，它在未分化的中枢神经系统细胞中表达。

SOX2也在CNS中神经上皮的未分化细胞中表达。巢蛋白和SOX2阳性细胞百分比从第4天下降到第21天，证实了谷氨酸能神经元的分化状态。微观图像揭示了谷氨酸能神经元在微流体装置上的逐渐分布。

当将BT35和UW479加入培养物中时，观察到第21天胶质瘤细胞接种后存在漂浮细胞，其逐渐消失直到第23天并在装置中粘附。BT35和UW479的活细胞百分比具有可比性，并暗示患者来源的细胞系可以得到适当使用。培养第23天的尖峰检测和光栅图显示，在添加儿科高级别胶质瘤细胞后，电活动增加。

为了监测神经网络活动的同步性，记录了BT35或谷氨酸能神经元的瞬时放电速率。第23天，单独培养和共培养的谷氨酸能神经元之间的电活动差异显著。进一步的方法论发展可以包括网络的功能评估与突发分析和网络的特殊时间互相关。

现在，研究人员有了一个有前途的工具来探索儿科高级别胶质瘤肿瘤系和高PSC神经元的相互作用和药理学靶向。可以使用几种肿瘤线和几种神经元类型。