Les interactions entre les cellules de gliome malin et leurs neurones environnants suscitent de plus en plus d’intérêt. Ici, nous montrons le développement d’un modèle in vitro co-cultivant des neurones glutamatergiques corticaux dérivés et des cellules tumorales. Les dispositifs microfludiques utilisés pour les co-cultures couplées à des réseaux multiélectrodes permettent d’étudier différents types de cellules et d’effectuer des enregistrements d’activité électrique à différents points temporels des cultures.
Cette méthode est particulièrement utile pour les études fonctionnelles et mécanistes et pour analyser les effets des agents pharmacologiques qui bloquent la migration des cellules de gliome pédiatrique de haut grade et l’interaction avec les neurones. Pour commencer à cultiver les neurones glutamatergiques corticaux humains commercialisés dérivés de l’IPS, videz les réservoirs d’entrée et de sortie du dispositif microfluidique par aspiration de pipette, en laissant seuls les canaux de l’appareil être remplis de milieu. Ensemencez les cellules IPS humaines en ajoutant 10 microlitres de 6,5 millions de cellules IPS humaines par suspension millilitre dans le milieu et laissez l’appareil être sous le capot pendant 15 minutes pour permettre aux cellules de se fixer.
Après 15 minutes, remplissez les réservoirs d’entrée et de sortie avec 50 microlitres de milieu de culture du quatrième jour, puis transférez l’appareil dans l’incubateur pour maintenir les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 23 jours. Remplacez le support tous les trois à quatre jours comme décrit dans le texte. Pour compter les cellules et évaluer la viabilité à l’aide d’un microscope à contraste de phase standard, prenez des photos microscopiques au 4e jour, au 21e jour et au 23e jour.
Cultiver les lignées cellulaires UW479 et BT35 dans du DMEM et du F-12 GlutaMAX complété par du sérum bovin fœtal à 10% dans une fiole de culture cellulaire. Maintenir la culture cellulaire dans un environnement contrôlé à 37 degrés Celsius dans des conditions normoxiques tout au long de l’expérience. Observez chaque lignée cellulaire pour atteindre 80% de confluence.
Le jour 21 de la post-culture de neurones glutamatergiques, commencez la co-culture en trypsinisant les cellules UW479 et BT35. Ensemencez les cellules TRYPSINISÉES UW479 et BT35 sur les neurones glutamatergiques adhérents matures dans chaque dispositif microfluidique dédié. Maintenir les co-cultures pendant deux jours dans un environnement contrôlé à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec le neurone glutamatergique D11 et le milieu ultérieur.
Compter les cellules de gliome pédiatrique de haut grade à l’aide des images microscopiques analysées avec le logiciel d’analyse d’images pour évaluer leur viabilité et calculer le pourcentage de cellules. Placez le MFD dans l’appareil d’enregistrement et utilisez un logiciel disponible dans le commerce pour effectuer l’enregistrement électrophysiologique des neurones glutamatergiques le 21ème jour. Avant d’ensemencer des cellules de gliome pédiatrique de haut grade, effectuez un deuxième enregistrement électrophysiologique des neurones glutamatergiques différenciés cultivés comme témoin parallèlement à la co-culture.
Effectuer un autre enregistrement électrophysiologique le 23ème jour après deux jours de co-culture. Les neurones glutamatergiques corticaux humains dérivés de l’IPS ont été caractérisés et évalués à l’aide de nestin, SOX2, des récepteurs métabotropiques du glutamate II et de l’immunocoloration VGLUT1. Nestin est une protéine de filament intermédiaire et elle a été exprimée dans des cellules indifférenciées du SNC.
SOX2 a également été exprimé dans des cellules indifférenciées de l’épithélium neural dans le SNC. Le pourcentage de cellules nestines et SOX2 positives a diminué du quatrième jour au 21e jour, confirmant l’état différencié des neurones glutamatergiques. Les images microscopiques ont révélé une distribution progressive des neurones glutamatergiques à travers les dispositifs microfluidiques.
Lorsque BT35 et UW479 ont été ajoutés à la culture, il a été observé que les cellules flottantes étaient présentes après l’ensemencement des cellules de gliome le 21ème jour, qui ont progressivement disparu jusqu’au 23ème jour et sont devenues adhérentes dans l’appareil. Les pourcentages de cellules viables pour BT35 et UW479 étaient comparables et impliquaient que les lignées cellulaires dérivées de patients pouvaient être utilisées de manière appropriée. La détection de pics et le tracé raster au 23e jour de culture ont montré une activité électrique accrue après l’ajout de cellules de gliome pédiatrique de haut grade.
Pour surveiller la synchronicité de l’activité du réseau neuronal, la vitesse de déclenchement instantanée dans les neurones BT35 ou glutamatergiques a été enregistrée. La différence d’activité électrique entre les neurones glutamatergiques cultivés individuellement et co-cultivés était significative le 23ème jour. D’autres développements méthodologiques peuvent inclure l’évaluation fonctionnelle du réseau avec une analyse en rafale et des corrélations temporelles temporelles spéciales du réseau.
Maintenant, les chercheurs ont un outil prometteur pour explorer les interactions et le ciblage pharmacologique des lignées tumorales de gliome pédiatrique de haut grade et des neurones à PSC élevé. Plusieurs lignes tumorales et plusieurs types de neurones peuvent être utilisés.
