Yazarlar, bu protokol optimize ona yardım Tiffany Kiraz teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (AG032320) yanı sıra Sağlıklı Wisconsin ilerlemek tarafından finanse edildi.

Homojenat prosedür başından temel bir şematik Şekil 1 bakın. Elüsyon CaM bağlı proteinler, hücre ekstreleri hazırlanması için tahmini süre yaklaşık altı-yedi saat. 1. Doku hazırlanması <ol><li> Organotipik hipokampal dilim ilgi rekombinant protein (bu örnekte, yeşil flüoresan protein (GFP) etiketli Ng) ve doku gecede protein ifade etmek için izin ifade eden bir plazmid içeren bir virüs enjekte edilir. </li><li> Yaklaşık 12 ila 18 saat viral enjeksiyondan sonra (viral ifade bağlı olarak), doku toplamak için hazırlamak. Petri 1mL diseksiyonu tamponu (5% O 2 CO 2% 95 ile gaz verilerek 10mM glikoz, 4mm KCl, NaHCO3 26mm, 233mm sakaroz, 5mM MgCl 2, 1mm CaCl 2 ve% 0.1 fenol-kırmızı,) ekleyin. Petri kültür dokusu / eklemek aktarın ve doku batığın eklemek için 2mL diseksiyonu tampon ekleyin. </li><li> Toplamat doku hafifçe bir neşter kullanılarak ekleme zarının serbest kazıma Organotipik hipokampal doku (5 ila 10 dilim). Özellikle ilgi belirli bir bölgede (örneğin CA1) kaldırmak da bir seçenektir. 1.5mL mikrosantrifüj tüp ters bir Pasteur pipeti kullanarak askıya alınan doku transferi. </li><li> 1 dakika için 1500 RCF diseksiyonu tampon ayrı doku örnekleri santrifüjleyin. Aspirasyon ile süpernatantı dikkatlice çıkarın. Pelet rahatsız değil emin olun. </li><li> Kullanılan her dilim için, homojenizasyon tampon (150mm NaCl, 20mm Tris pH 7.5, 1mm DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antipain, 1μg/mL pepstatin ve% 1 Triton X 30 60 mcL ekleyin -100) doku ve havaneli ile iyice karıştırılır. </li><li> Hücresel enkaz kaldırmak için, 10 dakika süreyle 1100 RCF kalan Homojenat santrifüj ve pelet gelen kirlilik kaçınarak dikkatle aspirasyon ile süpernatantı kaldırmak. </li><li> Girişi (örnek 1) bir örnek olarak süpernatant% 10 atın. 3. adımda kullanmak için CaM-sepharose boncuk hazırlanması sırasında buz üzerinde kalan süpernatant saklayın. </li></ol> Not: Burada kullanılan doku Organotipik hipokampal dilimleri. Ancak, bir ayrışmış nöron ya da başka herhangi bir hücre kültür sistemi kullanabilirsiniz. Böyle bir durumda, uygun bir şekilde doku toplama sonra 1.4 adım başlar. 2. Açılan boncuk hazırlanması Boncuk işleme, boncuk boncuk tüp tarafta kurumasını engelleyerek kurtarma ve reaksiyonların verimliliği en üst düzeye çıkarmak için önemlidir. Bunu yapmak için, hemen santrifüj önce, çözüm tüpün duvarlarına boncuk ıslak izin, kendi taraflarında tüpler döndürmek için en iyisidir. <ol><li> Çünkü her açılan askıya Kalmodulin-sepharose boncuk, 2 mL mikrosantrifüj tüpe pipet 400 mcL nispeten flat-alt inkubasyon sırasında boncuklar ile çözümler yüzey alanı ve etkileşimi en üst düzeye çıkarmak için. </li><li> 30 saniye boyunca 21.000 RCF boncuk Santrifüj ve dikkatli bir aspirasyon ile süpernatantı kaldırmak. Boncuk rahatsız değil emin olun. </li><li> Boncuklar yıkamak için açılan Ca 2 +-Cam boncuklar için bağlayıcı proteinlerin ve 2 mM EDTA (Ca 2 bilinen + şelasyon) aşağı çekmek için kullanılan bu CaCl 2 2 mM ya içeren ilgili homojenizasyon tampon 100 mcL ekleyin ApoCaM bağlayıcı proteinlerin. 1 dakika için 1500 RCF yavaşça yeniden askıya boncuk ve santrifüj tüp dokunun. Boncuk rahatsız değil emin olun, aspirasyon ile süpernatantı dikkatlice çıkarın. </li></ol> Not: tüm aspirasyon adımlar için, boncuk çıkarmadan çözüm çıkarılmasına olanak sağlayan güzel bir açılış (örneğin jel yükleme ipuçları) bir pipet kullanılması tavsiye edilir. 3. Proteinlerin CaM-sepharose bağlanma <ol><li> Bir eşit miktarda içeren iki koşula süpernatant Bölünmüş. Durumuna bağlı olarak, her biri için 2 mM konsantrasyon supernatant CaCl 2 veya EDTA uygun miktarda ekleyebilirsiniz. </li><li> Ilgili homojenizasyon tamponunda yıkanan boncuk adım 1.7 &#39;den süpernatant ekleyin. Yavaşça karıştırın tüp dokunun. </li><li> 4 ° C &#39;de örnek bir çalkalayıcı üzerinde 3 saat süreyle inkübe edin. Bağlama verimliliğini artırmak için boncuklar her 30 dakikada bir ya da yeniden askıya alabilir. </li><li> 3 dakika santrifüj tüpüne 1.500 RCF içeren örnekleri ve boncuklar. </li><li> Süpernatant 50μL bağlanmamış protein (örnek 2) bir örnek olarak alın ve dikkatli bir aspirasyon ve atın geri kalan süpernatant kaldırmak. </li><li> 100μL ilgili homojenizasyon tampon kullanarak adım 2.3 &#39;de açıklandığı gibi boncuk üç kez yıkayın. </li></ol> 4. Elüsyon <ol><li> Tam tersi bir durum (10mM C içeren elüsyon tampon (50mm Tris-HCl, pH 7.5, ve 150mm NaCl) 50μL ekleboncuklar ACL 2 veya 10mM EDTA). Örneğin, Ca 2 içeren tampon homojenize ve bağlı idi örnek + EDTA ve tersi elüsyon tampon içeren kolonda sürüklenecektir. </li></ol> İsteğe Bağlı: boncuk ekleyerek verimi artırabilir elüsyon tampon Isınma 37 ° C önce. <ol start="2"><li> Çalkalayıcı üzerinde 30 dakika süreyle oda sıcaklığında boncuklar ile inkübe edin çözüm. Her 5 dakikada yaklaşık tüp hafifçe dokunarak boncuk karıştırın. </li><li> 3 dakika 1500 RCF boncuk Santrifüj ve dikkatli bir aspirasyon bağlı protein (Örnek 3) süpernatant 50μL kaldırmak. Boncuk rahatsız değil emin olun. </li><li> Tüm örnekleri (yani homojenizatı bağlanmamış ve bağlı protein gibi bu hala boncuk bağlı) protein yükleme tamponu ekleyin. </li></ol> Not: elüsyon (özellikle verimsiz elüsyon durumda) en üst düzeye çıkarmak için, ilgili elüsyon tampon 50μL (örneğin EDTA içeren tampon ekleyerek eklemekkalan bağlı protein ve 4.3 &#39;te kalan bağlı proteinler kaldırmak için açıklanan adımları tekrarlayın Zehir yardımcı numune ısıtma öncesi boncuk) CaCl 2 bağlı boncuk ferin. 5. SDS-PAGE ve western blot SDS-PAGE Davranış ve pozitif kontrol olarak tersi durumda CaM bağlamak için bilinen bir protein ilgi ve prob protein problama western blot ile analiz. 6. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 2B endojen Ng göre GFP etiketli Ng CaM bağlayıcı bir test CaM-pull-down testinin bir örnek gösterir. Bunu yapmak için, GFP-Ng gecede Organotipik hipokampal dilimler halinde aşırı eksprese edildiği ve doku homojenize edildi. Homojenat Ca 2 + veya EDTA varlığında CaM-sepharose boncuklar ile inkübe edildi. Homojenat giriş GFP-Ng endojen Ng ve Ca 2 + / CaM-bağımlı kinaz II ek ifade olduğunu gösterir(CaMKII). Olarak bilinen endojen Ng (Şekil 2A gösterildiği) bağlama göre beklenen Ng, Ca 2 + (EDTA bağlı protein) yokluğu ve Ca 2 + varlığında bağlanmamış (Şekil 2B) yıkandı, GFP- etiketli . Buna karşılık, kontrol, CaMKII, Ca 2 + (bağlı protein) varlığı sadece madde elde edilmiştir ve onun yokluğunda (EDTA) bağlanmamış. Bu CaM boncuk düzgün çalışıp çalışmadığını gösterir ve elutions verimli. En önemlisi de, GFP-Ng ApoCaM endojen formuna benzer bir şekilde bağlanır, bu gösteriler, GFP etiketi bizim rekombinant proteinin işlevini değiştirmek olmadığını düşündürmektedir. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1: CaM açılan tahlil. Anahat (A) Doku Homojenat hücresel enkaz kaldırmak için aşağı döndüğünde. Süpernatant yaklaşık% 10&#39;u girişi (1) bir örnek olarak alınır. Kalan süpernatant farklı eşit olarak bölünür.koşulları ve bu koşullara uygun reaktifler (CaCl 2 veya EDTA) bağlayıcı test etmek için eklenir. Her supernatant (CaCl 2 veya EDTA içeren) sırasıyla hazırlanmış CaM-sepharose boncuk yüklenir ve (B) bağlayıcı izin vermek inkübe. Unbound proteinler kaldırıldı (2) ve (C) bağlı proteinler (3) bağlayıcı olarak tam tersi bir durum içeren elüsyon tamponu (EB) kullanarak boncuk kolonda sürüklenecektir. Bu üç protein örneklerinin protein bileşimi, SDS-PAGE ve western blot analizi kullanılarak analiz edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 Ca 2-pull test örnekleri A.) şematik +-bağımlı CaM bağlayıcı ve elüsyon iki tür protein bağlama CaM Ca 2 +-bağımlı bir şekilde verilmiştir. Neurogranin (Ng) bind apo-CaM ve CaMKII, Ca 2 + zengin bağlama proteinleri temsil ettiği proteinlerin temsil ederCaM. CaM Homojenat proteinleri ile inkübasyondan önce, ayrışmış durumda gösterilir. Bir kez + şelasyon, EDTA (2 mM), proteinler buna göre CaM bağlamak, yüksek Ca 2 + konsantrasyonu (2 mM) koşulları altında ya da Ca 2 varlığında inkübe edildi. Ng hiçbir Ca 2 + için biraz var gibi EDTA durumda CaM bağlanır ve Ca 2 + varlığında CaM-sepharose boncuk yıkandı, olurdu. Ancak CaMKII, Ca 2 yüksek miktarda varlığı CaM bağlamak + ve Ca 2 + şelatlı kez ayrıştırmaları. B.) örnek CaM açılan tahlil sonuçları. Bu rakam bir CaM-sepharose beklenen Sonuçta Ng ve CaMKII için probed örnekleri ile aşağı çekme göstermektedir. Endojen Ng ve GFP-Ng EDTA varlığında CaM bağlı proteinlerin şerit mevcut. Örnekleri, Ca 2 + varlığında CaM ile inkübe edilir Hayır gösteren Ng, bağlı olduğu Ng sadece apo-CaM bağlar. Öte yandan, pozitif kontrol, CaMKII, sadece Ca 2 varlığında CaM bağlanır +.

<ol>
	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin,+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein.">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li><li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+(RC3+protein,+neurogranin)+from+rat+brain.">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction.">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li><li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Ca 2 +-CaM-bağlayıcı proteinlerin bağımlılığı araştırmak için sağlanan protokol CaM-sepharose boncuk kullanır. Çoğu protein, Ca 2 +-bağımlı bir şekilde CaM bağlanır . Bu etkileşimler CaM-bağlayıcı proteinlerin ve birçok sinyal yolakları kritik bir rol sayısı göz önüne alındığında büyük önem taşımaktadır. Bu protokol, CaM-sepharose boncuk CaM-bağlayıcı proteinlerin varlığı ya da yokluğu, Ca 2 + doku Homojenat ayırmak için kullanılır . ...

<table border="1"><tr><td> Ürün </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> Kalmodulin-sepharose boncuk </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CamKII alfa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Jel Yükleniyor pipetleyin İpuçları </td><td> Balıkçı </td><td> 02-707-138 </td><td> Süpernatantlar aspirasyonu için kullanın. </td></tr><tr><td> Mikrosantrifüj tüpleri (2.0 ml) </td><td> Balıkçı </td><td> 05-408-146 </td><td> Kalmodulin-sepharose boncuklar içeren tüm adımları için kullanın </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Kalsiyum (Ca 2 +), çeşitli mekanizmalar aracılığıyla hücresel fonksiyonları düzenleyen hayati bir iyon . Ca 2 + sinyalizasyon kalmodulin (CaM) 1,2 olarak bilinen kalsiyum-bağlayıcı protein aracılığıyla. CaM apoptoz, metabolizma, düz kas kasılması, sinaptik plastisite, sinir büyüme, enflamasyon ve immün yanıt da dahil olmak üzere hemen hemen tüm hücresel süreçleri birden fazla seviyelerde yer almaktadır. Proteinlerin bir dizi CaM ile etkileşim yoluyla bu yollar düzenlenmesine yardımcı olurlar. Bu etkileşimlerin bir çoğu, Ca 2 +, Ca 2 +-devlet (ApoCaM) 3 karşı (Ca 2 +-CaM) bağlı farklı CaM, konformasyon bağlıdır . Çoğu hedef proteinlere Ca 2 bağlama iken + CaM, bazı proteinler sadece ApoCaM bağlamak. Neuromodulin 4, neurogranin (Tr) 5, ve belirli Miyosinler de dahil olmak üzere kendi IQ etki alanı ile Bazı bağlama CaM <sup&gt; 6. Bu proteinler, sırasıyla, presinaptik fonksiyonu 7, 8 postsinaptik fonksiyonu, ve kas kasılması 9 önemli rol oynamaktadır gösterilmiştir . Bağlamak ve Ca 2 varlığı veya yokluğu CaM serbest + yeteneklerini kendi fonksiyonu çok önemlidir. Buna karşılık, birçok proteinler sadece Ca 2 +-CaM bağlamak ve onların aktivasyonu için bu bağlayıcı gerektirir. Örnekler miyozin hafif zincir kinaz 10, Ca 2 + / CaM-bağımlı kinazlar (CaMKs) 11 ve fosfatazlar (örneğin kalsinörin) 12 ve 14 doğrudan ve mansap etkileri bir çeşitlilik var spectrin kinaz 13, içerir. Bu proteinlerin hücre fonksiyonu üzerinde etkileri genellikle CaM Ca 2 +-bağımlı bir şekilde bağlamak için yeteneklerini bağlıdır. Örneğin, farklı mutasyon bu bağlayıcı nasıl etkilediğini sinaptik fonksiyon Tr-CaM bağlama uygunluğu test edilmiş ve. Biz bir GFP etiketli Ng con oluşturulanNg, Ca 2 +-bağımlı bir şekilde CaM bağlamak yeteneğini değiştirmek istiyorsunuz IQ etki alanında belirli mutasyonları ile yapı . Sinaptik fonksiyon 8,15 yer alan önemli süreçler, bu farklı mutasyonlar çalışma bize büyük bir fikir verdi. Ancak, bu tür çalışmaların, mutasyona uğramış proteinler CaM beklenen değiştirilmiş bağlayıcı sahip olduklarını göstermeleri şarttır. Burada, örnek olarak CaMKII ve Ng kullanarak, Ca 2 + varlığı ya da yokluğu CaM bağlamak için proteinlerin yeteneğini test etmek için bir yöntem sunar. Bu yöntem afinite kromatografisi CaM açılan test olarak adlandırılan bir form. CaM-sepharose boncuk CaM ve Ca 2 + bağlayıcı bir etkisi bağlayan proteinleri test etmek için kullanır. Bu verimli, çok daha fazla zaman ve kolon kromatografisi ve diğer testleri göre daha az protein gerektirir. Toplamda, bu Ca 2 + / CaM sinyalizasyon ve proteinlerin ki keşfetmek için değerli bir araç sağlarCaM ile teract.

Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Kalmodulin (CAM) açılan test CaM çeşitli proteinler ile etkileşimi araştırmak için etkili bir yoldur. Bu yöntem, etkili ve spesifik CaM-bağlayıcı proteinlerin analizi için CaM-sepharose boncuk kullanır. Bu hücresel fonksiyonları CaM sinyal keşfetmek için önemli bir araç sağlar.

Kalmodulin bağlayıcı Proteinler, Pull-down

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Research

JoVE Journal

Biology

25.3K Görüntüleme.  Medical College of Wisconsin. Kalmodulin (CAM) açılan test CaM çeşitli proteinler ile etkileşimi araştırmak için etkili bir yoldur. Bu yöntem, etkili ve spesifik CaM-bağlayıcı proteinlerin analizi için CaM-sepharose boncuk kullanır. Bu hücresel fonksiyonları CaM sinyal keşfetmek için önemli bir araç sağlar.

Video: Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Proteinlerin Elektrogöçer Ayırma

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Biyoloji

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Jeller içinde Proteinler Boyama

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Proteinlerin Hücre Biyolojisi Microcontact Baskı

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Farelerde Hidrodinamik Gen Taşıyıcı Proteinlerin Geçici İfadesi

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).