Bu protokol önemlidir, çünkü Polimerik nanopartiküllerin, kapsüllenmiş nükleik asitlerin tek bir adımda nasıl hazırlanacağını gösterir. Bu tekniğin temel avantajları, farklı nükleik asitlere ve hücre tiplerine uygulanabildiği için çok yönlülüktür. Yukarı ve aşağı pipetleme gibi parçacık hazırlama için basit prosedürlerin kullanılması ve nanopartiküllerin ve tambur koşullarının stabilitesini liyofilizasyon ile genişletme imkanı.
Prosedürü gösterenler Laura Olmo, Coral Garcia-Fernandez, Maria Stampa Lopez-Pinto ve laboratuvarımızın doktora öğrencisi Maria Navalon-Lopez ve laboratuvarımız için bir posta doktoru olan Marta Diaz-Caballero olacak. Polikleks oluşumu için, daha önce hazırlanmış polimerleri, C6 peptidi, poli beta amino esterleri ve çözeltiyi girdapla çözün. Polimer karışımını yukarı ve aşağı pipetledikten sonra, sodyum asetat içinde 12,5 milimoler bir çözelti hazırlayın.
Çözümü vorteks edin ve 10 dakika bekleyin. Daha sonra, mililitre başına 0,5 miligramda mRNA hazırlayın ve pipetleme ile karıştırın. Polimer çözeltisini tekrar girdaplayın, ardından polimer çözeltisinde genetik malzeme çözeltisini bire bir oranında mikro santrifüj tüpünde karıştırın ve tüpü bir Termok'ta 30 dakika boyunca 25 santigrat derecede kuluçkaya bırakın.
Kuluçkadan sonra, numuneyi suyu içeren bir mikro santrifüj tüpüne ekleyerek karışımı bir ila iki RNase serbest su ile çökeltin, ardından ekscipientleri dahil etmek için, mRNA ve poli beta amino esterlerin karışımıyla aynı hacimde 20 milimoler yığın ve% 4 sakkaroz çözeltisi ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Polyplex çözeltisini eksi 80 santigrat derecede bir saat dondurduktan sonra Liyofilizasyon için, birincil kurutmayı yapın, ardından yeniden sulanmayı önlemek için polikleksleri hemen eksi 20 santigrat derecede saklayın. Çok yönlü resüspensiyon için, liyofilize nano parçacıkları eksi 20 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve katıyı yeniden dağıtmak ve istenen konsantrasyonu elde etmek için ilgili miktarda derin hidrojenize suyu hızla ekleyin.
Pipet toplam resüspensyona kadar yavaşça ve bir kez çözündükten sonra, pipet yukarı ve aşağı kabarcıkları şiddetle önler. Floresan mikroskopi ile nitel değerlendirme için 24 saatlik transfeksiyondan sonra, transfected Hela hücrelerini içeren 96 kuyu plakasını mikroskopa yerleştirin ve 10 kez amacı kullanarak görselleştirmeye başlayın. İlk olarak, yazılım için bir arka plan referansı oluşturmak için beyaz bir denge uygulayın, ardından analiz sırasında floresan görüntüyle kaplamak için bir görüntü elde edin.
Mikroskop modunu yansıma moduna değiştirin ve EGFP'yi görselleştirmek için filtre tekerleğini mavi lazere taşıyın. Ardından, aynı pozlama süresini kullanan tüm koşullar veya kuyular için görüntüler elde edin. Akış sitometrisi ile nicel değerlendirme için, hela hücrelerini kuyu başına 100 mikrolitre PBS kullanarak 96 kuyu plakasında yıkayın.
PBS'yi kuyu başına 25 mikrolitre tripsinle aspire ettikten sonra ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Hücreler ayrıldıktan sonra, trypsin'i inaktive etmek için önceden kurtarılan ortamı ekleyin, ardından kuyu başına% 10 formalin 31.25 mikrolitre ekleyerek ve 20 dakika boyunca inkübasyon yaparak hücreleri sabitleyin. Daha sonra akış sitometresini ve yazılımı açın, ardından plaka numune hacminin türü ve numuneler arasında titreme ve durulama gibi diğer parametreler de dahil olmak üzere deney için uygun koşulları ayarlayın.
Hücreleri enkazdan ayırmak için önce akış verilerini ileri dağınık ışığa karşı yan dağınık ışıkta görüntüleyerek pozitif transfected hücrelerin yüzdesini ölçmek için uygun parametreleri ayarlayın. Ve sonra başka bir dağılım pilotu çizerek, genlik ile yüksekliği geçitle karşılaştırıp tek tek hücreleri ayırt etmek. Transfection'dan bir gün önce, bir gecede inkübasyon için 96 kuyu plakasında kuyu başına 10.000 JAWS II hücresi plakası.
Ertesi gün hücreleri kuyu başına 0,6 mikrogram mRNA ile transfect ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit kuru hava inkübatöründe 24 saat boyunca plakayı kuluçkaya yatır. Ertesi gün, kuyuda kalan hücreleri 25 mikrolitre PBS ile yıkayın. PBS'yi 25 mikrolitre tripsinle aspire ettikten sonra ve hücreleri ayırmak için plakayı 37 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın.
Daha önce kurtarılan medyayı muhabire iyi ekleyerek trypsin reaksiyonunu durdurun. Daha sonra plakayı santrifüjleyin, ortamı aspire edin ve kuyu başına 50 mikrolitre PBS ve% 2.5 formalin ekleyerek hücreleri sabitleyin ve plakayı 20 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübasyon yaparak plakayı santrifüjleyin. Daha sonra kuyu başına 50 mikrolitre PBS ve% 3 BSA ekleyin ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübatör ekleyin.
Kuluçka santrifüjü plakayı tekrar santrifüj ettikten sonra, PBS'de 50 mikrolitre fare ovalbumin antikorunu ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca% 3 BSA ve inkübatör ekleyin. Santrifüjleme adımını tekrarlayın, ardından hücreleri 50 mikrolitre PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire ettikten sonra, ikincil antikorları ekleyin ve dört santigrat derecede bir saat kuluçkaya yaslanın.
Kuluçkadan sonra, santrifüj ve yıkama adımlarını tekrarlayın. Daha sonra akış sitometri analizi için hücreleri ve 100 mikrolitre PBS ve% 2.5 formalin'i yeniden biriktirin. Taze ve liyofilize GFP mRNA kapsülleme nanopartiküllerinin fizyokimyasal karakterizasyonu, boyut ve poli dispersiyon indeksinde önemli bir fark göstermez.
Poliklekslerin iletim elektron mikroskopisi, yaklaşık 50 nanometre çapında küresel ve mono dağınık nanopartiküllerin oluşumunu doğrular. Bir Lego peptidi ve GFP'yi kapsülleyen değiştirilmiş poli beta amino ester poliplexlerinin kapsülleme verimliliği verileri veya ovalbumin, mRNA türüne bağlı olarak önemli bir fark göstermez. EGFP ekspresyonunun nitel analizi, JAWS II hücre hattında işlem sonrası 24 saat burada gösterilmiştir.
Negatif kontrolle karşılaştırıldığında nicel olarak. Yüzde GFP pozitif hücreler önemli ölçüde daha yüksektir ve klasik transfeksiyon reaktifi ile gerçekleştirilen pozitif bir kontrolle karşılaştırılabilir. Ovalbumin mRNA yüklü oligopeptid ve modifiye poli beta amino ester nanopartiküller, transkriptif olmayan hücrelere kıyasla transkriptif hücrelerde CD11b ve CD86 membran belirteçlerinin önemli ölçüde daha yüksek ekspresyumu ile görüldüğü gibi dendritik hücreleri aktive edebilir.
MRNA'nın aktif prensip olarak kullanılmasına dayanan aşılama platformumuz ve tescilli polimerlerimiz profilaksi ve kanser terapötiklerinde kullanılmak üzere uyarlanabilir. Teknolojimizi kanser immünoterapistiğine bu katkıyı vurgulamak için kullanabiliriz. Nanopartiküllerimizde tümörle ilişkili antijenleri kapsülleyebildiğimiz ve kanser tedavilerinde bir değişiklik yapabileceğimiz için.
