Enzim koruma tahlili, Staph aureus içselleştirmesinin kapsamını ve bağlı hücrelerin içinde hayatta kalma yeteneğinin yanı sıra antimikrobiyal bileşiğin etkinliğini incelemeyi sağlar. Geliştirilmiş enzim koruma tahlili, teknik kullanımı büyük ölçüde basitleştirir ve içselleştirilmiş bakterileri zayıf yapışan hücrelerden ve süspansiyondaki hücrelerden kurtarmayı sağlar. Prosedürü gösteren josselin Rigaill, tıp doktoru ve laboratuvarımdan doktora öğrencisi.
Enfeksiyon testlerinden iki gün önce, 24 kuyu plakasının kuyusu başına mililitre başına 2.0 çarpı 10 ila beşinci hücrelere 2.0 kat yoğunlukta tohum A549 epitel hücreleri ve % 100 izdihama ulaşana kadar hücreleri% 5 karbondioksitte 36 santigrat derecede 48 saat kuluçkaya yatır. Tahlil günü, harcanan kültür ortamını A549 hücrelerini saymaya adanmış üç kuyudan çıkarın ve atın ve Hoechst 33342 mililitresi başına beş mikrogram ve mililitre propidium iyodür başına bir mikrogram içeren bir mililitre tam enfeksiyon ortamı ekleyin. Hücreleri 30 dakika kuluçkaya yatırın, ardından geniş alan floresan mikroskobu kullanarak hücre sayısını sayın ve hücre canlılığını hesaplayın.
Bakteri süspansiyonunu hazırlamak için, bir tüpe 25 mililitre tam enfeksiyon ortamı dağıtın ve 36 santigrat derecede önceden ısıtın. Daha sonra, Staphylococcus aureus süspansiyonunu bir hücre yoğunluk ölçer kullanarak tam bir enfeksiyon ortamında 0,5 OD'ye ayarlayın, ardından kültürü tam bir enfeksiyon ortamında seyrelterek kuyu başına hücre sayısına göre bir MOI elde etmek için hücre aşılaması için 20 mililitre bakteri süspansiyonu hazırlayın. Daha sonra, otomatik bir spiral plaka kullanarak, hücre aşılama adımı için kullanılacak seyreltilmiş bakteri süspansiyonunun Staphylococcus aureus yükünü belirleyin ve agar plakalarını 36 santigrat derecede 18 ila 24 saat kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, test edilen her gerinim için doğru MOI'yi hesaplamak için koloni sayacı olan kolonilerin sayısını sayın. Hücre aşılamasından önce, hücrelerin sağlıklı ve beklendiği gibi büyüdüğünden emin olmak için düşük büyütme mikroskopisi ile 24 kuyu plakasının her kuyusuna gözlemleyin, ardından harcanan hücre kültürü ortamını 24 kuyu plakasından çıkarın ve atın ve% 100 izdinizli hücreler içeren her kuyuya bakteri süspansiyonunun 500 mikrolitresini ekleyin. Hücreleri %5 karbondioksitte 36 santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatır.
Hücre içi bakterileri geliştirilmiş enzim koruma tahlili ile ölçmek için, metin elyazmasında belirtildiği gibi çalışma çözümlerinde 4x lizis tamponu, %2 Triton X-100, tripsin-EDTA ve lizostafin stoğu hazırlayın. Daha sonra, lysostaphin çalışma çözeltisinin 250 mikrolitresine altı mililitre tam enfeksiyon ortamı ekleyerek lysostaphin ile desteklenmiş 6,25 mililitre tam enfeksiyon ortamı hazırlayın. Daha sonra, her kuyuya lysostaphin ile desteklenmiş tam enfeksiyon ortamından 250 mikrolitre ekleyin ve plakayı elle döndürerek plakayı hafifçe çalkalayın.
Lisostafin hücre dışı bakterileri öldürmesine izin vermek için, hücreleri % 5 karbondioksitte 36 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın, ardından her kuyuya mililitre başına 20 mikrogramda 10 mikrolitre proteinaz K ekleyerek ve hücreleri oda sıcaklığında iki dakika inkübe ederek lizostaphin'i etkisiz hale getirin. Daha sonra, hücreleri ozmotik şokla izne çıkarmak için 250 mikrolitre 4x lizis tamponu ekleyin ve hücreleri 36 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya bırakın. Kuluçkadan sonra, hücrelerin tamamen lised ve homojenize olduğundan emin olmak için hücreyi birkaç kez yukarı ve aşağı doğru pipetlayın, ardından her kuyunun Staphylococcus aureus yükünü belirlemek ve agar plakalarını 36 santigrat derecede 18 ila 24 saat kuluçkaya yatırmak için otomatik bir spiral plaka kullanın.
Ertesi gün, her kuyunun hücre içi Staphylococcus aureus yükünü hesaplamak için koloni sayacı olan kolonilerin sayısını sayın. Staphylococcus aureus'un iki suşunun A549 epitel hücreleri tarafından içselleştirilmesi burada tasvir edilir. Lysostaphin'i çıkarmak için yıkamaları içeren enzim koruma testini kullanarak, SF8300 vahşi tipi ve fnbA ve B genlerinden yoksun izojenik mutant için mililitre başına ortalama hücre içi yükler 4.46 ve 0.49 log cfu'ydı.
Lysostaphin'i inaktive etmek için proteinaz K kullanan geliştirilmiş enzim koruma testini kullanarak, yükler mililitre başına sırasıyla 4.53 ve 0.56 log cfu'ydı. Enzim koruma tahlili kullanılarak ölçülen Staphylococcus aureus'a karşı vankömiksin, rifampicin ve levofloksasin hücre içi aktivitesi burada tasvir edilir. Ortalama hücre içi yükler kontrol için mililitre başına 4.57 log cfu, vankomasin için 4.51, rifampicin için 3.03 ve levofloksasin için 2.91 olarak belirlendi.
Enzimi çıkarmak için yoğun yıkamalar, en enfekte hücreleri ayırma eğilimindedir, bu da yanlış sonuçlar verebilir ve geliştirilmiş protokolün kullanımını destekleyebilir. Geliştirilmiş enzim koruma tahlilleri, Staph aureus içselleştirmesinin organoid ile incelenmesini kolaylaştırır ve koyarak kullanılan yüksek içerikli tarama sistemine kolayca uyarlanabilir
