AAA-ATPases'in proteinleri lipid bilayerden çıkarmak için kullanılması protein kalite kontrolünde yaygın bir temadır. Bu temel sürecin mekanistik bir anlayışı, yeniden inşa edilmiş bir sistem gerektirir. AAA-ATPases ile önceki rekonstruş karmaşık ve heterojendi.
Sistemimiz basit ve tam olarak tanımlanmıştır. Bu, AAA-ATPase Msp1, substrat ve lipid ortamını manipüle etmemizi sağlar. Başlamak için, daha önce hazırlanmış yeniden yapılanma tamponu, saflaştırılmış Msp1 ve TA proteinlerini ve lipozomlarını bir PCR tüpüne ekleyin, ardından karışımı 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya bırakın.
Kuluçka sırasında, bir P200 pipet ucunun ucunu bir inçin yaklaşık 1/8 çapındaki kısmına kesin. Daha sonra, düzgün bir karışım elde etmek için BioBeads içeren tüpü iyice girdaplayın. Ardından, kapağı hızlı bir şekilde çıkarın ve boncukların uygun bir hacmini boş bir PCR tüpüne aktarmak için kesilmiş P200 pipet ucunu kullanın.
Yeniden yapılanma için 10 dakikalık inkübasyon tamamlandıktan sonra, kesilmemiş bir pipet ucu kullanarak, biobeads'tan tüm sıvıyı çıkarın. Daha sonra, 100 mikrolitre rekonsiyel biobeads ile tüpe aktarın ve 16 saat boyunca bir tekerlek üzerinde dönmesine izin verin. Ertesi gün, boncukları peletmek için tüpü bir PicoFuge'da döndürün, ardından yeniden inşa edilen malzemeyi temiz bir PCR tüpüne aktarın ve tüpü buzda tutun.
Lipozomlara yeniden inşa edemeyen proteinleri çıkarmak için, glutatyon spin sütunlarını ekstraksiyon tamponu ile dengeleyin, bu da tipik olarak 400 mikrolitre tamponla üç tur yıkamayı ve ardından tamponu çıkarmak için santrifüjlenmeyi içerir. Daha sonra, yeniden inşa edilen malzemeye her bir refakatçiden beş mikromol ekleyin, ardından 100 mikrolitre ekstraksiyon tamponu, hacmi 200 mikrolitreye kadar getirin. Bu karışımı dengelenmiş glutatyon spin sütunlarına ekleyin, ardından spin sütunlarını takın ve 30 dakika döndürerek refakatçilerin reçineye bağlanmasını bekleyin.
Döndükten sonra sütunları kısa bir süre döndürün. Agrega proteinlerinin önceden temizlenmiş malzemesi olan akış toplayın. Buzun üzerine yerleştirin ve doğrudan çıkarma testine geçin.
Tüpleri SDS-PAGE analizi için hazırlayın. Giriş tüpüne 45 mikrolitre çift damıtılmış su, akış tüpüne 40 mikrolitre su ve her tüpe 16,6 mikrolitre 4X SDS-PAGE yükleme tamponu ekleyin. Ekstraksiyon tahlil için ekstraksiyon reaksiyonu hazırlayın ve ekstraksiyon tamponu ile son hacmi 200 mikrolitreye getirin.
Daha sonra, ekstraksiyon tahlilini 30 santigrat derecelik bir ısı bloğunda iki dakika boyunca ön ısıtma yapın. Tahlil başlatmak için, atp'yi iki milimol son konsantrasyona ekleyin. Tüpü bir PicoFuge'da beş saniye döndürün ve 30 dakika boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sırasında, reaksiyonun beş mikroliter örneğini alın ve giriş tüpüne ekleyin. Ayrıca, ekstraksiyon testinde her örnek için daha önce gösterildiği gibi bir glutatyon spin sütunu aşındırın. 30 dakikalık inkübasyon tamamlandıktan sonra, tüpe 200 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ekleyin ve toplam hacmi 400 mikrolitreye getirin.
Daha sonra, bu reaksiyonun dengelenmiş glutatyon reçinesine ekleyin ve dört santigrat derecede 30 dakika dönmesine izin verin. Döndükten sonra, akış akışını toplamak için sütunları döndürün, ardından akış tüpü için 10 mikroliterlik bir örnek alın. Reçineyi 400 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ile iki kez yıkayın, her yıkamadan sonra akıştan atın.
Üçüncü yıkamadan sonra, akışı tutun ve yıkama tüpü için 50 mikroliter numune alın. Daha sonra, ekstraksiyon tamponunda beş milimollük son konsantrasyona azaltılmış glutatyon ekleyerek beş mililitrelik elüasyon tamponu hazırlayın. Spin sütununa 200 mikrolitre elution tamponu ekleyin ve beş dakika kuluçkaya yatırın.
Ardından, sütunu santrifüj edin ve akışı toplayın. İfade adımını bir kez daha tekrarlayın. İkinci elutiondan sonra, elution örneğinden 50 mikroliter aliquot alın ve elute tüpüne ekleyin.
Batı lekesi çalıştırılmasından sonra, ekstraksiyon verimliliği, elute fraksiyonundaki substrat miktarı ile giriş fraksiyonu karşılaştırılarak belirlenebilir. Akıştaki sinyal bazı değişkenlik gösterir, ancak genellikle giriş fraksiyonu ile benzer ve yıkama fraksiyonunda sinyal yoktur. Tipik olarak, pozitif kontrol için yaklaşık% 10 ekstraksiyon verimliliği ve negatif kontrol için% 1 ila% 2 ekstraksiyon verimliliği vardır.
Yeniden yapılanma koşulları optimize edilmemişse, ekstraksiyon seviyeleri pozitif ve negatif numuneler arasında karşılaştırılabilir. Bu teknik, laboratuvarımızın alt tabakanın biyofiziksel özelliklerinin Msp1 tarafından tanınmasını etkilemesini test etmesine izin sağladı.
