Bu protokol transkripsiyon olaylarını gözlemlemeye ve tespit etmeye izin verir ve DNA çift iplikçik kırılmalarının bir genin devam eden transkripsiyonu üzerindeki etkileri hakkında fikir verir. Tekniğin ana avantajı, tek tek hücrelerde tek tek etiketli RNA transkriptlerinin bir saat veya daha uzun bir süre boyunca saniyeler içinde gözlemlenmesidir. Bu yöntem, transkripsiyon ve DNA replikasyonu ve DNA lezyonları gibi hücresel süreçler arasındaki çapraz sapı araştırmak için DNA hasarı yanıtı hakkında fikir verir.
Tavsiyemiz, doksiksin kullanarak hücreleri gözlemlemek ve transkripsiyon bölgesinin ve etiketli RNA moleküllerinin tespitini eğitmek için kalibrasyon ölçümleri yapmaktır. 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde, transfeksiyon yardımcı reaktifinde 150 mikrolitre azaltılmış serum MEM plazma DNA'sı ve DNA mikrolitresi başına 2,5 mikrogram içeren A çözeltisini hazırlayın. Buna paralel olarak, lipid bazlı transfeksiyon reaktifinde 150 mikrolitre azaltılmış serum MEM ve DNA mikrolitresi başına 1,5 mikrogram içeren B çözeltisini hazırlayın.
Her iki çözeltiyi de oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya bırakın, ardından B çözeltisine A çözeltisini hafifçe ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri transfect etmek için, her yemeğe 300 mikrolitre karışık çözelti A ve B damla yönünde ekleyin ve yavaşça dağıtın. Cam alt kabı 100 milimetre standart hücre kültürü çanağının içinde saklayın ve % 5 karbondioksit ile nemli bir atmosferde 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Fenol kırmızısı olmayan ve%10 kömürle sıyrılmış fetal sığır serumu ile desteklenmiş HEPES ile 200 mikrolitre DMEM ile 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpü hazırlayın, ardından TA ekleyin. Mikroskopi gözlemine başlamadan yaklaşık bir saat önce, büyüme ortamına doksiksin ekleyerek muhabir genlerinin transkripsiyonunu başlatın ve 200 mikroliter mikropiplet ile yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hafifçe karıştırın. Gözleme başlamadan en az 30 dakika önce hücreleri mikroskopa taşıyın ve 100 milimetrelik kabı önceden ısıtılmış büyük mikroskop inkübasyon odasının içindeki hücrelere yerleştirin. Mikrosantrifüj tüpünü önceden seyreltilmiş TA ile birlikte büyük mikroskop çevre odasının içine yerleştirin ve 37 santigrat dereceye ısıtın.
Cam alt kabın kapağını delinmiş üç milimetre çapında deliği olan bir kapakla değiştirin. Mikroskop kontrol panelinde 100X yağ daldırma hedefini seçin ve hedefe bir damla daldırma yağı uygulayın. Cam alt kabı mikroskop aşaması inkübasyon odasının içindeki hücrelerle ayarlayın ve yerine kilitleyin, ardından sahne inkübatörünün kapağını ve mikroskop muhafazasının tüm kapılarını kapatın.
Mikroskop işletim ve kontrol yazılımını başlatın, odak kontrol penceresini açın ve kapsam bölmesini tıklatın. Emisyon seçim bölmesinde, göz tarafından doğrudan örnek gözlemi için oküler ışın yolunu ayarlamak üzere %100 göz kutusunu tıklatın. Filtre kümesi menüsünde göz filtresi kümesine geçin ve Brightfield'ı tıklatın, ardından Açık Brightfield düğmesine basın.
Yağ cama temas edene kadar mikroskop hedefini cam alt kabına doğru hareket ettirin. Okülerlere bakın ve hücrelerin düzlemine manuel olarak odaklanın, ardından açık Brightfield düğmesini kapatın. Deneysel gözlemlere başlamadan önce hücreleri 30 dakika bekleterek çevresel koşullara uyum sağlamalarını ve sıcaklık gradyanları nedeniyle görüntüleme sırasında odak sürüklenmesini önlemelerini sağlayın.
Oda sıcaklığında 200 mikrolitre mikropipette ve 200 mikrolitre filtre ucu ayarlayın. Mikroskop kontrol yazılımının odak kontrol penceresinde lazer yoğunluğunu %5 olarak ayarlayın ve pozlama süresi için 50 milisaniyelik bir değer girin. Üç boyutlu zaman çakışmalarının otomatik görüntü alımını gerçekleştirmek üzere ayarları yapmak için yakalama penceresini açın.
3B yakalama alım türünü seçin ve 0,4 mikrometre ile ayrılmış 12 ila 16 optik dilim ayarlayın. Geçerli aralığın onay kutularını işaretleyin ve yakalandıktan sonra geçerli konumuna dönün. Zaman yakalama bölmesinde, zaman noktası sayısı için 120 ve aralık için 30 saniye değeri girin.
Metin el yazmasında belirtildiği gibi transekte edilmiş floresan protein etiketlerine göre konfokal filtre kümesini seçin ve her kanal için pozlama süresini 50 milisaniye olarak ayarlayın. Odak penceresinde seçilen %5 değerini kullanmak için lazer gücü için ayar akımını kullanın. Odak kontrolü penceresinde, kamera bölmesine gidin, ölçek görüntüsü görüntü denetimini seçin ve görüntülenecek sabit bir görüntü yoğunluğu aralığı ayarlamak için manuel düğmeyi seçin.
DNA çift iplikçik kırılması indüksiyonu üzerine transkripsiyon bölgelerinin 3D timelapse görüntülemesi için hücreleri seçin. Hücreleri tarayın ve metnin tartışmasında açıklanan koşullara göre üç görünüm alanı seçin. Daha önce görüş alanının ortasında bulunan seçilen her hücreyi, Z yığınının orta düzleminde transkripsiyon sitesiyle odakla.
Ayar noktasını tıklatarak odak kontrol penceresinin XY düzleminde her XYZ konumunu işaretleyin. Hücrelere önceden seyreltilmiş TA'nın 200 mikrolitresini ekleyin ve yakalama penceresinde başlat'a tıklayarak 3D zaman serisi görüntülemeye başlayın. Görüntüleme verilerini mikroskop kontrol bilgisayarı sabit sürücüsündeki mikroskop kontrol yazılımı veri biçiminde kaydedin.
Miksoskopi görüntü alımına başlamadan bir saat önce hücrelerin büyüme ortamına mililitre başına 0,5 mikrogram ekleyin. Cam alt kabı mikroskop aşaması inkübasyon odasının içine monte edin ve görüntü alımını daha önce gösterildiği gibi hazırlayın. Daha önce olduğu gibi aynı lazer yoğunluğu ve pozlama ayarlarını kullanın.
2D zaman serisi için yakalama ayarlarını yapın ve timelapse yakalama panelinde 500 milisaniye aralıklarla 120 zaman noktası ayarlayın. Birkaç yüz tek transkript TFI ölçümünü saymak için veri kümeleri oluşturmak için birden fazla konumdan düzinelerce kalibrasyon zaman serisi elde edin. Bu protokol kullanılarak, floresan etiketli muhabir gen transkriptlerinin sayısını zaman içinde, saatlere kadar olan sürelerde saniyeler içinde zamansal bir çözünürlükle gösteren bir grafik elde edilir.
Nascent transkriptleri üzerinde yeşil floresan protein molekülleri ile etiketlenmiş MS2 kat proteininin birikmesi ile etiketlenmiş bir PROM muhabiri gen transkripsiyon sitesinin TFI değerlerinin zaman seyri burada gösterilmiştir. Muhabir genlerinde tek bir DSB'nin indüksiyonu, devam eden muhabir gen transkripsiyonu ve DSB bölgesinden ortaya çıkan transkripsiyon olaylarının izlenmesi, yani kırılma kaynaklı transkripsiyon üzerindeki etkisinin incelenmesini mümkün kılar. Bir DSB'nin TA ilavesi ve indüksiyonu, 60 dakikaya kadar restore edilmeden yaklaşık 11 dakika sonra PROM muhabiri gen transkripsiyonunun baskılanmasına yol açar.
PP7-RFP sinyalinin tamamen kurtarılması, kırılmaya bağlı transkripsiyon başlatmasını gösterir. EXON 2 antisense muhabir geni, daha sonra antisens MS2 kök döngü dizilerinden oluşturulan RNA'ya kırmızı floresan protein bağlanması ile etiketlenmiş MS2 kat proteininin birikmesiyle ortaya çıkan antisens kırılma kaynaklı transkripsiyon ile değiştirilen promotör güdümlü transkripsiyonların sonlandırılmasını gösterir. Görüntüleme için hücrelerin seçimi, etiketli transkripsiyon bölgesinin Z konumunu elde edilecek Z yığınının ortasına ayarlayarak tedavi edilen timelapse görüntülemeyi ayarlayın.
Ve son olarak, önceden seçilmiş pozisyonların görüntülenecek hücrelerle herhangi bir şekilde değişmesini önlemek için büyüme ortamına seyreltilmiş TA'nın eklenmesi aşırı özenle yapılmalıdır. Canlı hücrelerde zaman içinde tek RNA transkriptlerinin 3D olarak görüntülenmesi, DNA replikasyon sırasında RNA transkripsiyonunu veya hücre döngüsü ilerlemesi sırasında transkripsiyon değişikliklerini incelemek için uygulanabilir.
