Protokolümüz, araştırmacıların büyüyen kollateral arterlerde immün hücre aderansını ve ekstravazasyonunu gerçek zamanlı olarak izleyerek in vivo arteriyogenez sürecini analiz etmelerini sağlar. Multifoton mikroskopi tekniği, canlı fare modellerinin derin dokusundaki hücre dinamiklerinin düşük fototoksisiteye ve yüksek uzaysal zamansal çözünürlüğe sahip olarak görselleştirilmesini sağlar. Mikroskop prosedürü, Dr. Helen Ishikawa-Ankerhold'un laboratuvarından multifoton görüntüleme platformundan teknik asistan Dominic van den Heuvel tarafından gösterilecek.
Cerrahi prosedürü göstereceğim. Başlamak için, anestezi uygulanan fareyi sırtüstü pozisyona getirin. Ardından, adduktör kasının düzlemsel bir pozisyonunu sağlamak için farenin üst arka bacağının altına iki parça kalıplanmış kil yerleştirin.
Fareyi stereo mikroskopun altına yerleştirin. Saçları her iki bacaktan çıkardıktan sonra, cildi sağ arka bacağın daha erken femoral arter ligasyonunun izi etrafındaki bir daire içinde dezenfekte edin ve kesin. Deri ve yağ tabakasını bacağın üstünden çıkarın ve kollateral damarlarla adduktör kasının etrafında bir cep oluşturmak için dikişler kullanarak kalan cildi bir kenara çekin.
Daha sonra, adduktör kası, profunda arteri ve venin yanı sıra kollateral damarların net bir görünümünü elde etmek için deri altı yağını çıkarın. İnce forsepsler kullanarak kollateral damarların üstündeki yüzeysel kas tabakasını çıkarın. Dokunun kurumasını önlemek için hazırlanan cebi salinle doldurun ve sahte ameliyat edilen sol arka bacak için aynı prosedüre devam edin.
Görüntülemeden önce, her iki cebe de kurumayı önleyen ve hedefle optik bağlantı için daldırma ortamı görevi gören ultrasonik jel ekleyin. Titanyum safir lazer kutusunun, elektronik arayüz kutusunun, inkübatör odasının ısıtma ünitesinin, floresan lambanın ve bilgisayarın anahtarını açın. Satın alma yazılımını başlatın.
Dalga boyunu 800 nanometreye ayarlayın ve mikroskop deklanşörünü açın. Ölçüm sihirbazı iletişim kutusunda, cihaz modunu tek ışın ve ölçüm modunu 3B tarama hızlandırması olarak seçin. Daha sonra anestezi uygulanmış fareyi mikroskobun önceden ısıtılmış inkübasyon odasına aktarın ve ultrasonik jel ile alanı doğrudan objektif ön lensle temas halinde konumlandırın.
Epifloresan mikroskop deklanşörünü açın. Ardından, FTSE görselleştirmesi için yeterli bir filtre veya dikroik ayar seçin. Epifloresan aydınlatma altında kan akışını takip ederek ilgi alanını tanımlayın.
İlgilenilen alanı orta görüş alanına getirdikten sonra, epifloresan mikroskop deklanşörünü kapatın. XY tarayıcı iletişim kutusunda, görüntü boyutu, piksel, frekans, çizgi ortalaması için gerekli parametreleri ayarlayın. Lazer gücünü ayarlayın ve yeşil, kırmızı ve mavi kanallar için fotoğraf çarpanı kazancını ayarlayın.
İntravital görüntüleme ve sürüklenme düzeltme ayarları için yeterli bir hedef seçin. Ölçüm sihirbazı iletişim penceresindeki kırmızı düğmeye basarak önizleme alma modunu başlatarak görüntü yığını aralığını tanımlayın. İyi görüntüler elde etmek için, odaklanarak ilgi alanını ve yapısını tanımlayın.
Ekranı gözlemlerken, görüntü kaybolana kadar hedefi hareket ettirerek odağı değiştirin ve sıfır olarak ayarlayın. Hedef konumu eksenel yöndeki son konum olarak ayarlayın. Ardından, görüntü ekrandan tekrar kaybolana kadar hedefi aşağı doğru hareket ettirerek odağı ters yönde değiştirin.
Ölçüm sihirbazı iletişim kutusunun sol üst köşesindeki durdur düğmesine tıklayın ve adım boyutunu iki mikrometre olarak ayarlayın. Ölçüm sihirbazı iletişim kutusunda ilk eksen aygıtı olarak python eksenini seçin ve otomatik kaydetme modunu etkinleştirme'yi seçin. Ardından, otomatik kaydetme kutusunu yalnızca zaman ekseninde işaretleyin.
Ardından, Python iletişim penceresini açmak için kullanılabilir cihazlar penceresindeki Python simgesine basın. Python iletişim kutusu ekseni ayarlarında, başlangıç ve bitiş bölümlerini girin, ardından adım sayısını girin. XYZ sahne Z iletişim penceresine gidin ve tarama aralığını her iki uçta da 200 mikrometre genişletin.
Bunu yapmak için, başlangıçta 200 mikrometre girin ve sonunda eksi 240 mikrometre girin ve aralık otomatik olarak eksi 440 mikrometre olarak ayarlanacaktır. VivoFollow ön uç iletişim kutusunu açın. Ölçüm sihirbazı iletişim kutusunun sol üst köşesindeki yeşil ok ucuna basarak görüntü yakalamayı başlatın.
Canlı sapma düzeltmesi kullanılıyorsa, sapma düzeltme yapılandırmasının görünmesi için bir iletişim kutusu arayın. Ardından, mobil yer işareti referansında olduğu gibi kullanılan edinme kanalını ayarlayın. İlk ve son Z konumlarına eklenen mikrometre cinsinden maksimum düzeltme ofsetini girin ve Tamam'ı tıklatın. Vivo akış ön uç iletişim penceresinde görüntü toplama sırasında X, Y ve Z'deki mevcut sapma ofsetini gerçek zamanlı olarak izleyin ve başka bir anestezi yeniden enjeksiyon döngüsü gerektiğinde 35 dakika sonra görüntüleme alımını durdurun.
MMF karışımının yarım dozunu enjekte edin ve deney bitene kadar görüntüleme alımını yeniden başlatın. Bu araç uzun süreli görüntü yakalamaya izin verir, yüksek kaliteli veri toplamaya olanak tanır ve hız ölçümleri için hücreleri izlemek için uygundur. Sürüklenme düzeltmesi olmadan gösterildiği gibi, ilgilenilen bölge giderek kayıt görünümünden uzaklaşır ve hız analizi için hücreleri izleme yeteneğini etkiler.
Bununla birlikte, sürüklenme düzeltme yazılımı ile kararlı filmler kaydedilebilir ve uzun bir süre boyunca daha fazla hücre izlenebilir. Sapma düzeltme yazılımı, sistem tarafından düzeltilen zaman içindeki X, Y ve Z ofsetlerinin görselleştirilmesini de sağlayabilir. Multifoton mikroskopisi, lökosit takibi için hücre migrasyon adımlarının ve hızının izlenebileceği ve izlenebileceği yüksek bir uzaysal zamansal çözünürlük sunar.
Kollateral damarları çoklu foton görüntüleme için hazırlayarak, kollateral arterlerin zarar görmesini önlemek önemlidir. Görüntülemeden önce, doğru kollateral arteri güvenli bir şekilde tanımlamak önemlidir. Kollateral arterlerin intravital multifoton görüntülemesinin bu yeni prosedürü ile, antikor etiketini değiştirerek tüm kan hücrelerinin aderansını ve ekstravazasyonunu in vivo olarak analiz etmek mümkündür.
