Bu deneyin genel amacı, bizim hindlimb iskemi modeli deney putatif anjiyojenik ajanların fonksiyonel, histolojik ve moleküler etkileri kapsamlı bir değerlendirme için bir temel ışık etmektir. Bu protokol, klinik bağlamda gelecekteki uygulamalar için potansiyel ile küçük bir hayvan modeli olası anjiyojenik tedavilerin test için bir standart alanları. Kritik iskemi hastalarının %20-30'unda revaskülarizasyon uygun olmadığı için terapötik anjiyogenez iskemik bölgede kan profüzyonunu iyileştirmek için yeni bir strateji olarak ortaya çıkmıştır.
Bu deneysel protokol, anjiyojenik tedavilerin her bir sonuçlarındaki etkinliğini ölçmede etkilerini uyguladıkları mekanizmaların kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlayabilir. 22 haftalık C57 siyah altı dişi farede ayak parmak kıskacına yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, sağ arka bacaktan saçı tıraş edin ve hayvanı ısıtılmış bir ped üzerinde kübitpozisyona kadar sırtta sabitler. Hayvanı bir kesme mikroskobu altına yerleştirin.
Ve sağ arka bacak uyluk üzerinde bir santimetre deri kesi yapmak için bir numara on bir cerrahi neşter bıçak kullanın. Künt nörovasküler demet ortaya çıkarmak için deri altı yağ incelemek. Ve distal dış iliak ve femoral damarları ortaya çıkarmak için membranöz ileofemoral kılıf açmak için sivri forceps, bahar makas ve oftalmik iğne tutucu kullanın.
Diseksiyon ve sinir arter ve ven ayıran sonra, distal femoral arter ve ven ve distal dış iliak arter ve ven ligate için yedi O emilir polipropilen sütür kullanın. Distal eksternal iliak arterin tanımlanması, distal eksternal iliak ile femoral arter ve damarların ligasyonu ve eksizyonu işlemin başarısı için kritik öneme yöneliktir. Distal ve proksimal düğümler arasındaki iliofemoral arter ve damarlar segmentini transect için bahar makası kullanın.
Ve kesiği emilebilir bir dikişle kapatın. Daha sonra, peritoneally hayvan içine antisitif çözüm teslim ve tam iyileşme kadar izleme ile ev kafesi için fare dönmek. Gastroknemius kasları hasat etmek için, her iki arka bacaklardan deri kaldırın.
Ve kasları deri ayırmak için pamuklu bez kullanın. Aşil tendonu tutarak, diz eklemine kadar tibia ve fibula kas ayırmak için bahar makası kullanın. Ve pazı femorisi gastroknemius kaslarından ayırın.
Diz eklem düzeyinde gastroknemius kas eklemeleri kesmek için bahar makası kullanın. Ve küçük bir mantar disk üzerinde enine yönde hasat kasları konumlandırmak için% 10 trigasanth kullanın. Daha sonra, sıvı nitrojen soğutulmuş isopentane eksi 80 santigrat depolama için numuneleri ani dondurma.
Kapiller mikrodiseksiyon lazer yakalama için, kas örneklerinin 12 mikrometre bölümleri elde ettikten sonra, eksi yirmi derece santigrat beş dakika boyunca soğutulmuş saf aseton 50 mililitre slaytlar dokuları düzeltmek. Hava kurutuldıktan sonra her numuneyi hidrofobik bir kalemle daire içine alın. Ve numuneleri PBS'de dört santigrat derecede iki azı kaşığı sodyum klorürle yeniden sulendirin.
Yeniden hidrasyon sonunda, bir gecede dört derece santigrat ilgi uygun birincil antikor ile örnekleri etiketleyin. Ardından, yıkama başına PBS'de taze iki azı kaşığı sodyum klorür iki üç dakikalık yıkar. İkinci yıkamadan sonra, dört santigrat derece de otuz dakika için uygun bir ikincil antikor ile uygun bir ikincil antikor ile etiket pbs sodyum klorür iki yıkar gösterildiği gibi.
Daha sonra, avidin konjuge peroksidaz kompleksi ile etiket otuz dakika dört santigrat derece. Bir yıkama ve DAB peroksidaz substrat ile etiketleme beş dakika izledi. Kuluçka sonunda, sıralı buz soğuk dokuları dehydrate 90%etanol ve% 100 etanol emersions.
Daha sonra, fare başına 10,000 kılcal damarı incelemek ve inceltme kılcal damarlarını mikrofuge tüpü yapışkan kapağına mancınık lamak için 355 nanometre lazere darbe ile donatılmış daha sonraki bir mikrodisese sistemi kullanın. Görüldüğü gibi hindlimb iskemi indüksiyonundan hemen sonra hindlimb perfüzyonunun tam bir kaybı gözlenir. ISC'nin NISC ekstremitesine oranı olarak ifade edilen kan akımının kan akımının kan titreşmesinde, 15 ve 45 hli sonrası pro-anjiyojenik uyarana maruz kalan farelerde önemli ölçüde gelişmiş ekstremite kan perfüzyonu gösterilmiştir.
Gastroknemius kas dokusu bölümlerinin histolojik bölümlerinde CD31 pozitif kılcal damarların nicelliği, iskemik olmayan ekstremitelere karşı kapiller yoğunluğun daha fazla olduğunu göstermektedir. Beklendiği gibi. Ama bu etki pro-anjiyojenik ajan ile tedaviden sonra daha da artar.
Kollateral damar yoğunluğu da iskemik ekstremitede sürekli olarak artar ve pro-anjiyojenik uyaranile maruz kaldıktan sonra bu artış önemli ölçüde daha yüksektir. CD31 pozitif endotel hücrelerinde pro-anjiyojenik gen ekspresyonunun ters transkripsiyonaz polimeraz zincir reaksiyonanalizi, pro-anjiyojenik ajana maruz kalan veya olmayan fareler arasında gen ekspresyonunda açık bir varyasyon olduğunu göstermektedir. Bu damar diseksiyon sırasında arter ve ven yırtılma önlemek için membranöz iliofemoral kılıf açmak için eski bir oftalmik iğne kullanmak önemlidir.
Lazer doppler bazlı perfüzyon ölçümleri ile kolayca değerlendirilen arka ekstremite iskemisine yanıt verir ve kapiller damar yoğunluğunun histolojik niceliği anjiyogenezi değerlendirmemizi sağlar.
