Sunulan protokol, hayvan dokusunda geniş bir lipit aralığının ölçülmesine izin verir. Lipit mekanizmalarını incelemek ve ayrıca hayvan modellerinde erken toksisiteyi gösteren biyobelirteçleri tanımlamak için kolay bir araçtır. Bu yöntem, numune başına 10 dakikalık bir trend süresiyle çok çeşitli numune matrislerinde 14 farklı lipit sınıfında 400'den fazla moleküler lipitin kantitatif bir profilini sunar.
Başlamak için, santrifüj aliquot 1 süpernatantını amonyum bikarbonat tamponu ile konsantrasyonun iki katı kadar seyreltin. Sığır serum albümin standart eğrisini hazırladıktan sonra, standart tüpleri vorteks edin ve tüpleri oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 18.200 g'da santrifüj edin. Daha önce hazırlanan standart tüplerden, boş, standartlar ve numunelerin her biri 6 mikrolitreyi 96 delikli düz tabanlı bir plakaya aktarın.
Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak her bir kuyucuğa 250 mikrolitre Bradford reaktifi ekleyin ve karıştırın. 5 dakika inkübe ettikten sonra, bir plaka okuyucu kullanarak absorbansı 595 nanometre dalga boyunda ölçün. Toplam boş ve iç standart boşluğun her bir tüpüne 100 mikrolitre amonyum bikarbonat çözeltisi ile 2 mililitrelik tüpler hazırlayın ve tüm numuneleri buz üzerinde tutun.
Kalite kontrol numuneleri hazırlanır, bir kalite kontrol numunesi göz önünde bulundurularak her 10 numune seti arasına yerleştirilir. 2 mililitrelik tüplere 10 mikrolitre havuzlanmış insan plazması ekleyin, ardından tüm dahili standart boşluklara, kalite kontrol ve çalışma örneklerine 10 mikrolitre dahili standart çözelti yerleştirin. Her numuneye 300 mikrolitre eksi 20 santigrat derece bütanol metanol karışımı ekleyin ve termomikserde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 g'da çalkalayın.
Daha sonra, 300 mikrolitre heptan etil asetat karışımı ekleyin ve termomikserde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 g'da çalkalayın, daha sonra 300 mikrolitre% 1 münzetik asit karışımı ekleyin ve termomikserde oda sıcaklığında 450 g'da 5 dakika çalkalayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.800 g'da santrifüj yapın ve üst fazın 360 mikrolitresini 2 olarak etiketlenmiş yeni bir 2 mililitrelik kendinden kilitli tüpe aktarın. 1 olarak etiketlenmiş su fazı tüpüne 320 mikrolitre heptan etil asetat ekledikten sonra, termomikser üzerinde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 g'da çalkalayın, daha sonra daha önce gösterildiği gibi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.800 g'da santrifüj yapın.
Üst fazın 320 mikrolitresini aktarın ve bunları tüp 2'deki önceki adımdaki fraksiyonla birleştirin. Benzer şekilde, tüp 1'deki su fazına 250 mikrolitre heptan etil asetat ekleyin ve termomikserde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 g'da çalkalayın. Yine, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.800 g'da santrifüj, daha sonra üst fazın 200 mikrolitresini aktarın ve tüp 2'deki önceki adımlardan fraksiyonlarla birleştirin.
Bir vakum yoğunlaştırıcıda 35 santigrat derecede kuruluğa buharlaşır ve 300 mikrolitre MS karışım çözeltisinde yeniden çözünür. Her şeyin çözünmesini sağlamak için her tüpü 5 saniye boyunca vorteks edin ve 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca 18.200 g'da santrifüjleyin. Pozitif iyonizasyon modu analizi için mikrolitre plakasına 50 mikrolitrelik bir aliquot aktarın ve 50 mikrolitre MS karışım çözeltisi ile seyreltin.
Yine, 80 mikrolitre MS karışımı ile seyreltin ve negatif iyonizasyon modu analizi için MTP plakasına 20 mikrolitrelik bir aliquot aktarın. Plakayı folyo ile sarın ve analizden önce 4 santigrat derecede tutun. Bir MS'i, analizden 5 gün veya daha kısa bir süre önce üreticinin talimatlarına uygun olarak hem pozitif hem de negatif modlarda kalibre edin.
Doğrudan infüzyon nano kaynağını önceden takın, MS'in transfer kılcal damarına ve çip tutucuya 4.1 mikrometrelik bir nozul çipine karşı düzgün bir şekilde hizalandığından emin olun, ardından 1.25 psi'lik bir gaz basıncına, 1.1 kilovoltluk kaynak voltajına, 5 mikrolitre numune enjeksiyon hacmine karşılık gelen pozitif ve negatif infüzyon parametrelerini kontrol edin, 2,5 saniye boyunca Rel1 çıkış kontağı kapatma, 5 dakika teslimat süresi, 4 santigrat derecede plaka soğutma, ardından sıcaklık kontrol cihazını kurun ve yeni bir plaka oluşturun. Pozitif mod için, MS yönteminin 250 santigrat derece kılcal sıcaklık ve 65.0'da S Lens RF seviyesi ile ayarlandığını kontrol edin ve ayarlayın. Xcalibur yazılımında, pozitif yöntemi açın ve tam tarama MS alımının, 1 milyonluk otomatik kazanç kontrolü ve 50 milisaniyelik maksimum enjeksiyon süresi ile 140.000 çözünürlükte 550 ila 1.000 m / z aralığında sıfırdan 1 dakikaya kadar ayarlandığını kontrol edin.
680.48022 kilit kütlesini uygulayın. Veriden bağımsız MS/MS alma yönteminin, 17.500 çözünürlükte 1 ila 5 dakikalık zaman aralığı arasında, 250 m/z'lik sabit bir ilk kütle ile ayarlandığını kontrol edin. MS2 için otomatik kazanç kontrolünün 100.000'de ve maksimum enjeksiyon süresinin 64 milisaniyede ayarlandığını, çarpışma enerjisinin 20 NCE'de, yalıtım penceresinin 1 m/z'de ayarlandığını ve 398'den 1.1.100 m/z'ye kadar bir dahil etme kütle listesinin 1 Dalton'luk bir kütle adımıyla kullanıldığını kontrol edin.
Negatif modda elde etmek için, MS yönteminin, MS ayar dosyasında 65.0'daki S-lens RF seviyesinde 250 santigrat derecede kılcal sıcaklık ile ayarlandığını ayar yazılımında kontrol edin. Daha sonra, Xcalibur yazılımında, tam tarama alma modunun 400 ila 940 m / z aralığını kapsayan 140.000 çözünürlükte sıfırdan 1 dakikaya, 1 milyonluk otomatik kazanç kontrolüne, maksimum 200 milisaniyelik enjeksiyon süresine ve 526.46262 kilit kütlesine ayarlandığını kontrol edin. DIA modunda MS2 alımının, 150 m/z'lik sabit bir ilk kütle, 100.000, 64 milisaniyelik maksimum enjeksiyon süresi ve 35 NCE çarpışma enerjisinin otomatik kazanç kontrolü ile 17.500 çözünürlükte 1 ila 5 dakikalık bir çözünürlükte 1 Dalton'luk bir kütle adımıyla 400'den 940'a kadar olan dahil etme kütle listesini kullanarak 1 ila 5 dakika arasında ayarlandığını kontrol edin.
Xcalibur yazılımında analiz sırası kuyruğunu pozitif modda oluşturun ve tetikleyin, ardından ChipSoft yazılımında diziyi oluşturun ve numune alımının her numune için doğrudan infüzyon robotundan gelen bir kontak kapatma sinyali ile tetiklenmesini beklerken analizi başlatın. Pozitif mod analizi tamamlandığında, Xcalibur yazılımında analiz sırası kuyruğunu negatif modda oluşturun ve tetikleyin, ardından ChipSoft yazılımında diziyi oluşturun ve numune alımının her numune için doğrudan infüzyon robotundan gelen bir kontak kapatma sinyali ile tetiklenmesini beklerken analizi başlatın. Toplam normalize lipid konsantrasyonu, PE, PEO, PC, PCO, PI ve PG lipid sınıfları için hafifçe yükselmiş olan en bol 14 lipit sınıfından tanımlanmış ve ölçülmüş ve SM, LPE ve PA lipitleri için bazı aşağı regülasyon gözlenmiştir.
TAG'ler ve PS için hiçbir fark görülemezken. Bu sonuçlar ayrıca, toplam moleküler formüle dayanan moleküler özellikler arasında, 100 ila 120 bileşiğin sigara dumanına maruz kalmaktan önemli ölçüde etkilendiğini göstermektedir. MS2 parçalanmasının dekonvolüsyonu ve fragman sinyal yoğunluklarının normalleştirilmesi, her lipit camında temsil edilen her konjuge yağ asidinin toplam miktarının yaklaşık olarak tanımlanmasına ve bu verilerin maruz kalan ve kontrol grupları arasında karşılaştırılmasına izin verdi. Tamamen doymuş ve az sayıda doymamış yağ asidinde bir azalma gözlenirken, PC, PE ve PG fosfolipid sınıflarının bileşimindeki çoklu doymamış yağ asitleri sigara dumanı grubunda tüm zaman noktaları için yükselmiştir.
Eikosapentaenoik ve dokosaheksaenoik asit ile konjuge edilmiş aşırı PC ve PG vakaları sadece 3R4F CS maruziyet grubunda tespit edildi. Numunenin ve QC numunesinin pipetlenmesi düşük bantlı uçlarla yapılmalı ve doğru olmalıdır, yani uçlar her numune arasında kontrol edilmelidir. Dahili standart çözümün pipetlenmesi kritik öneme sahiptir ve doğru olmalıdır.
1 ila 1 diklorometan metanol çözeltisi dikkatle ele alınmalı ve numunelerde plastik polimerlerin bulunmasını önlemek için plastikleştirici olmayan uçlar kullanılmalıdır. İpuçları her numune arasında değiştirilmelidir.
