Bu dikey, hücre zarı afinitesi kromatografisi kolonlarının fonksiyonel transmembran reseptörleri ile birleştirilmesinde önemli adımlar sunmaktadır. Bu sütunlar, karmaşık ekstraktlarda bulunan ve immobilize transmembran reseptörleri ile etkileşime giren küçük moleküllerin tanımlanması için kullanılabilir. Hücresel membran afinite kromatografisi sütunları, karmaşık karışımlarda bulunan biyolojik olarak aktif bileşiklerin tanımlanmasını hızlandırır.
Hücresel membran afinite kromatografisi sütunlarının kullanımı, bitki, mantar veya bakteri ekstraktları gibi karmaşık doğal matrislerde bulunan farmakolojik olarak aktif bileşiklerin tanımlanmasıyla ilgilenenler için özellikle ilgi çekici olabilir. Başlamak için, beş mililitre ultra saf deiyonize suda 120 benzamidin çözerek 200 milimolar benzamidin stok çözeltisi hazırlayın. Bir duman davlumbazında 10 mililitre etanol içinde 0.017 gram PMSF'yi çözerek 10 milimolar PMSF stok çözeltisi hazırlayın.
Ticari olarak temin edilebilen proteaz inhibitörü karışımını bir mililitre ultra saf deiyonize suda çözerek 100X proteaz inhibitörü kokteyli hazırlayın. İyice karıştırın ve kokteylin 200 ila 300 mikrolitresini alın. 55.114 miligram ATP disodyum tuzu hidratını bir mililitre iyonize ultra saf suda çözerek 100 milimolar ATP stok çözeltisi hazırlayın.
İyice karıştırın ve karışımın 100 mikrolitresini alın. 3.03 gram Tris-HCL, 2.9 gram sodyum klorür, 0.22 gram kalsiyum klorür susuz, 0.2 gram magnezyum klorür hekzahidrat ve 0.19 gram potasyum klorürü 500 mililitre ultra saf deiyonize suda çözerek tampon hazırlayın. 17.3 mililitre Tris tamponunu 0.3 mililitre benzamidin stok çözeltisi, 0.2 mililitre PMSF stok çözeltisi, 0.2 mililitre proteaz inhibitörü kokteyli, 20 mikrolitre ATP stok çözeltisi, iki mililitre gliserol ve 0.029 gram EDTA ile karıştırarak homojenizasyon tamponunu hazırlayın.
Hidroklorik asit çözeltisi kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın. Dört santigrat derecede hasat edilen hücreleri 400 x g'de beş dakika boyunca döndürün ve süpernatantı çıkarın ve kalan hücre peletini 10 mililitre 1X pH 7.4 buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Süpernatantı atın ve 20 mililitre homojenizasyon tamponu ekleyin.
Konik tüpü buzun üzerine yerleştirin. Hücre süspansiyonunu 40 mililitrelik bir Zıplama homojenizatörü doku öğütücüye aktarın, 40 yukarı ve aşağı havane darbesi kullanarak süspansiyonu buz üzerinde manuel olarak homojenize edin. Homojenize hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın, peleti atın ve süpernatantı yeni bir konik tüpe aktarın.
Hücre zarı peletini kaydedin ve süpernatanı atın. 8.7 mililitre tampon çözeltisini 0.1 mililitre PMSF stok çözeltisi, 0.15 mililitre benzamid stok çözeltisi, 0.1 mililitre proteaz inhibitörü kokteyli, 10 mikrolitre ATP stok çözeltisi, bir mililitre gliserol ve 0.2 gram sodyum kolat ile karıştırarak çözünür tamponunu hazırlayın. Çözünürizasyon tamponunu hücre zarı parçaları ile konik tüpe aktarın.
Ve peleti yeniden askıya alın. Elde edilen karışımı 18 saat boyunca dört santigrat derecede 150 RPM'de döndürün. 18 saat sonra, çözünür karışımını 47.900 x g'de 30 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj yapın.
100 miligram IAM ekleyin. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıklarını süpernatanta çevirir ve elde edilen süspansiyon karışımını bir saat boyunca dört santigrat derecede 150 RPM'de döndürür. 24 gram Tris-HCl, 23.4 gram sodyum klorür, 0.06 gram kalsiyum klorür, 5.85 gram EDTA ve 0.07 gram PMSF ekleyerek dört litre ultra saf deiyonize suda diyaliz tamponu hazırlayın.
PMSF'yi önce küçük bir etanol hacminde çözün ve ardından tamponla beherin içine yavaşça ekleyin. Diyaliz tüpü hazırlamak için 10 santimetrelik selüloz membran diyaliz tüpünü kesin ve IAM içeren süspansiyonu aktarın. Kişisel bilgisayar. DD2 parçacıkları ve hücre zarı parçaları diyaliz tüpüne girer.
Diyaliz tüpünün her iki ucunu diyaliz tüp klipsleriyle kapatın. Diyaliz tüpünü diyaliz tamponuna yerleştirin. 24 saat sonra, diyaliz tüpünü taze hazırlanmış diyaliz tamponuna yerleştirin ve 24 saat daha diyalize devam edin.
IAM'yi yıkamak için kullanılacak 10 milimolar pH 7.4 amonyum asetat tamponu hazırlayın. Kişisel bilgisayar. DD2 partikülleri ve kolon karakterizasyon deneylerinde 0.778 gram amonyum asetat bir litre ultra saf deiyonize suda çözülür. 48 saatlik diyalizden sonra, diyaliz tüpünü diyaliz tamponundan çıkarın ve diyaliz tüpünün içeriğini 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.
Süpernatantı atın ve kalan peleti 10 mililitre amonyum asetat tamponu ile üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, kalan peleti bir mililitre amonyum asetat tamponunda yeniden askıya alın. İyice karıştırın ve CMAC kromatografi sütununu elde etmek için 5 x 20 cam sütunu paketlemek için elde edilen bulamacı kullanın.
Sütunu paketlemek için, daha önce amonyum asetat tamponu ile ıslatılmış bir alt filtreyi filtre tutucuya yerleştirin. Filtre tutucuyu cam kolona takın ve tutucunun konumunu sabitlemek için kolon kapağını vidalayın. Kolonu dikey olarak bir parmak kelepçesine yerleştirin ve laboratuvar standına sabitleyin.
Kolonun altına bir beher yerleştirin, bulamacın küçük bir hacmini, pipet ucunu cam sütun duvarına doğru tutan tek kanallı bir pipetleyici ile yavaşça cam sütuna aktarın. Paketleme işlemini hızlandırmak için, tamponu sabit yatağın üstünden her adım arasında bir mikropipetle çıkarın. Bir üst filtre yerleştirin ve adaptör ünitesini, sabit fazın üzerinde kalan tampon kalmayacak şekilde vidalayın.
Adaptör ünitesinin konumunu adaptör kilidi ile sabitleyin. Kolonu yüksek performanslı bir sıvı kromatografi pompasına bağlayın ve kolonunu gece boyunca amonyum asetat tamponuyla yıkamak için akış hızını dakikada 0,2 mililitreye ayarlayın. Daha uzun süre saklamak için, kolonu, amonyum asetat tamponunda% 0.05 sodyum azid çözeltisi ile çalıştırın, sodyum azid ile çalışırken bir laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlükleri ve eldivenler giyin ve dört santigrat derecede saklayın.IAM.
Kişisel bilgisayar. DD2 partikülleri ile immobilize nöroblastom TrkB hücre zarı fragmanları ve BDNF varlığında floresan partiküller ile sonuçlandı. TrkB null hücre zarı kapsüllenmiş IAM partiküllerinde veya TrkB hücre zarı kapsüllenmiş IAM partiküllerinde olduğu gibi BDNF kullanılmadığında floresan gözlenmedi. İmmobilize TrkB reseptörlerine bir milimolar, 750 nanomolar, 500 nanomolar ve 300 nanomolar'ın 7, 8-DHF konsantrasyonlarını artıran fonksiyonel bir CMAC kolonu, retansiyon süresinde konsantrasyona bağlı bir değişiklik gösteren tipik bir frontal afinite kromatogramı gösterilmiştir.
İşlevsel olmayan bir CMAC kolonu, marker ligandın retansiyonunda konsantrasyona bağlı değişikliklerin eksikliğini gösterdi. Bir CMAC negatif kontrol kolonu, spesifik olmayan etkileşimleri dışlamak için hedeflenen proteini ifade etmeyen, hücre zarı fragmanlarını hareketsiz hale getirerek hazırlandı. % 0.2 sulu Gotu kola ekstraktının eklenmesi, agonist bağlanma bölgesi için rakip ligandların varlığını gösteren 7, 8-DHF retansiyonunda önemli bir azalma ile sonuçlandı.
CMAC negatif TrkB null kolonunda 7, 8-DHF retansiyonunun azalmaması, bu kolonda fonksiyonel TrkB reseptörlerinin eksikliğini daha da doğruladı. Eksik pik kromatografi yaklaşımı, TrkB sütununda güçlü bir şekilde tutulan bir bileşiği tanımlarken, TrkB null sütununda erken salınım yaparak spesifik etkileşimi gösterir. Hızlı hücresel membran afinitesi kromatografi sütunu için reseptör kaynağınızı bilmek çok önemlidir.
Homojenizasyon ve çözündürme tamponlarını doğru şekilde tasarlamak için literatürü kontrol ettiğinizden emin olun. Bu protokolde hazırlanan hücresel membran afinite kromatografisi kolonu, yeni potansiyel ilaç isabetlerini tanımlamak ve immobilize reseptör ile doğal ligandları arasındaki etkileşimin doğasını karakterize etmek için kullanılmıştır.
