This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.

<ol>
	<li>Murillo-Ferrol, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causal+study+of+the+earliest+differentiation+of+the+morphological+rudiments+of+the+extremities.+Experimental+analysis+on+bird+embryos.">Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos.</a> Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).</li><li>Sweeney, R. M., Watterson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rib+development+in+chick+embryos+analyzed+by+means+of+tantalum+foil+blocks).">Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks).</a> Am J Anat. 126 (2), 127-149 (1969).</li><li>Kieny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relations+between+somatic+and+somatopleural+mesoderm+before+and+during+primary+induction+of+chick+embryo+limbs.">On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs.</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268 (26), 3183-3186 (1969).</li><li>Pinot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+somitic+mesoderm+in+the+early+morphogenesis+of+the+limbs+in+the+fowl+embryo.">The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo.</a> J Embryol Exp Morphol. 23 (1), 109-151 (1970).</li><li>Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontrolled+release+of+biologically+active+compounds+in+chick+embryos:+beads+of+200-microns+diameter+for+the+local+release+of+retinoids.">Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids.</a> Anal Biochem. 142 (2), 542-555 (1984).</li><li>Cohn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factors+induce+additional+limb+development+from+the+flank+of+chick+embryos.">Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos.</a> Cell. 80 (5), 739-746 (1995).</li><li>Nishimoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RA+Acts+in+a+Coherent+Feed-Forward+Mechanism+with+Tbx5+to+Control+Limb+Bud+Induction+and+Initiation.">RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation.</a> Cell Rep. 12 (5), 879-891 (2015).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Stephens, T. D., McNulty, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+metameric+pattern+in+the+development+of+the+chick+humerus.">Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus.</a> J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).</li><li>Strecker, T. R., Stephens, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerves+do+not+play+a+trophic+role+in+limb+skeletal+morphogenesis.">Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis.</a> Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).</li><li>Riddle, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).</li><li>Ng, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limb+identity+gene+Tbx5+promotes+limb+initiation+by+interacting+with+Wnt2b+and+Fgf10.">The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10.</a> Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).</li><li>Takeuchi, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx5+and+Tbx4+trigger+limb+initiation+through+activation+of+the+Wnt/Fgf+signaling+cascade.">Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade.</a> Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).</li><li>Lee, J., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+pattern+formation+in+the+developing+chick+wing:+SEM+and+quantitative+studies+of+early+effects+on+the+apical+ectodermal+ridge+and+bud+outgrowth.">Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth.</a> J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).</li><li>Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+application+to+chick+wing+buds+leads+to+a+dose-dependent+reorganization+of+the+apical+ectodermal+ridge+that+is+mediated+by+the+mesenchyme.">Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme.</a> Devel. 106 (4), 691-705 (1989).</li><li>MacCabe, J. A., Parker, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+gradient+of+a+morphogenetic+substance+in+the+developing+limb.">Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb.</a> Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).</li><li>Summerbell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zone+of+polarizing+activity:+evidence+for+a+role+in+normal+chick+limb+morphogenesis.">The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis.</a> J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).</li><li>Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+reprogramme+pre-bud+mesenchyme+to+give+changes+in+limb+pattern.">Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern.</a> Devel. 100 (4), 723-733 (1987).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

Biz civciv embriyo ekstremite tomurcuğu oluşumunu önlemek için geçirimsiz engellerin kullanımını tanımlamak. Bu teknik, kritik adımlar bir numarası vardır. Ön deneyler ardından, 9 kullanılan menteşe şeklinde bariyerler, 10 düz engelleri çok daha iyi embriyo yerinde olduğunu ortaya koydu. Bariyerin uzak düz tarafı vitellin membran yapışır ve yeri (Şekil 2C &#39;)&#39; de bariyer tutar. protokolün adım 1.6 de tarif edildiği gibi alüminyum folyo menteşe şeklinde engeller dikkatli hazırlanması işleminin başarısı için çok önemlidir. İkinci önemli adım yumurta çok uzun pencereleme takip ve embriyo üzerinde faaliyet öncesinde evreleme için inkübatör dışına bırakılmış değil emin olmaktır. Bizim tecrübelerimize göre, embriyolar operasyon gerçekleştirildiği zaman onlar veya inkübasyon sıcaklığında yakınında ise bir operasyon daha iyi hayatta. Operasyon bu nedenle mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır ve yumurta istemi resealedly iyi sağkalım oranlarını sağlamak. Birçok araştırmacı inkübatör yumurta dönmeden önce mikrocerrahi aşağıdaki embriyoya antibiyotik bir damla ekleyin. sıvının mevcudiyeti pozisyonda de yapışmasını engeller engelledi. antibiyotik eklenmesi de yerleştirilmesinden sonra boncuk yerinden olabilir. Bu nedenle antibiyotik, hızlı operasyonlar ve aletleri ile iyi temizlik kullanmayan enfeksiyonu önlemek için tavsiye edilir. Bir işlemin her aşamasında, aşağıdaki% 70 etanol ile aletleri silme (protokol adım 3.1.2.2 bakınız) engeller veya boncuklar iki forseps bağlı neden olabilir Vitellin membran ile temas yapışkan hale gelen araçlar bilmek esastır. kullanılan boncuk Her iki çeşit operasyondan sonra yersiz düşebilir. bariyer pozisyonu ertesi gün kontrol edildi zaman boncuk yerinde ya da değil kalan olup olmadığını tespit etmek için bariyerini görmek mümkün değildi. boncuk düşmüştü durumlarda kanat tomurcuk akıbet kurtarıldı değildi ( <stRong&gt; Tablo 1). Onları implantasyonu sırasında boncuk ile sıvı transfer kaçınmak boncuk (protokol 2.3.2.3 bakınız) LPM kesilmiş yüzüne daha kolay sopa anlamına gelir. Sonunda embriyolar hasat iyi takip eden gen ekspresyon analizi için kritik hemen sonra sabit olmasını sağlamak (protokol adım 4.2). Bu protokol, uzuv tomurcuk başlamasını önlemek için engelleri kullanılan daha önce yayınlanan deneyleri değiştirir bariyerleri özel optimum genişlikleri tanımlar ve gen ekspresyon analizi takiben birleştirerek bariyer ve boncuk yerleştirme tanıttı. Biz ucuz ve tüm laboratuvarlarda hazır olan klasik alüminyum folyo kullanarak bulundu, daha önce tantal folyo kullanılan olanlar eşit sonuçlar üretir. Folyo in situ hibridizasyon (Şekil 2C &#39;)&#39; de yerine getirirken embriyoda yaptı ama birden fazla embriyo embriyolar zarar folyo keskin kenarları önlemek için işleniyor eğer biz genellikle kaldırmak olabilir. Pilot çalışmalar, bacak bölgesi engellerin genişliği özellikle önemli olduğunu göstermiştir. Başlangıçta trialed bariyerler çok kısa ve bacak tomurcuk akıbet engelledi değildi. 1.2-1.3 mm tamamen bacak tomurcuk akıbet engellemek için bir bariyer için optimum genişlik olduğunu. bir doğru yerleştirebilirsiniz dar kanat engelleri tomurcuk akıbet iyi sağkalım oranlarını vermek önlemek için. Bu 0.5-0.7 mm kadar dar olabilir. Ancak, biraz daha geniş olan engelleri (biz 0,7-1 mm kullanılır) onlar yerleştirme küçük bir yanlışlık izin çünkü kanat tomurcuk akıbet tam engellenmesine yol açar olasılığı daha yüksektir. kan damarlarının kaçınma zaman kesi yaparak kanat tomurcuk seviyesi engelleri için kritik öneme sahiptir. Yarı geçirgen bariyerler önce civciv bacak tomurcuk iki eşit parçaya böler için kullanılmıştır. MacCabe ve Parker, 1976 ve Summerbell, 1979 hem kullanılan filtreler sırasıyla 0.45 mikron ve 0,8 mikron gözenek boyutu, 16, 17. Onlar yayılabilir sinyaller filtreleri ve gözenekler yoluyla geçebileceği bildirildiSonuçlar yarı geçirgen bariyerler geçirimsiz bir tantal folyo bariyer ile hiçbir mevcut bariyer ve biriyle bacak tomurcuk arasındaki orta idi kullanılarak kazandı. Bu protokol, boyutu veya sinyal yayılma dinamiklerini değiştirme göre aday sinyalleri ayırt etmek için farklı gözenek büyüklüğü yarı geçirgen bariyerler kullanmak üzere adapte edilebilir. Bu protokol esas model organizma kendisi ile ilişkili çeşitli sınırlamalar vardır. Bu tür teknikler uzuv gelişiminde başka sorular ve aynı zamanda omurgalı embriyogenez diğer soruları araştırmak için kullanılabilir. Bir şartı civciv embriyo müdahale için erişilebilir olduğu zaman, söz konusu organı / alan geliştirme gerektiğidir. Bir bariyer yerleştirilmesi gereken bölgede büyük kan damarlarının varlığı bariyer yerleştirme sonraki aşamada 13 veya teknik açıdan zorlayıcı 14 daha yapar. büyük kan damarları bariyer yerleştirme sırasında kesilir ise bu embriyo mortaliteye neden olabilir. Transkripsiyon T faktörleri zaman bizim soruşturmaBX5 ve Tbx4 ilk LPM indüklenen daha sonra sırasıyla karşıt ya kanat veya bacak tomurcuk sona ereceğini bir bariyer koyabilirsiniz en erken aşamada sınırlı kalmıştır. Gastrulasyon yakın daha erken aşamaları ile TBX gen indüksiyonunu bloke girişimi aydınlatıcı olabilir. erken bir engel olası kanat bölgesinde yer olabilir başarıyla sahne 8 ve daha sonraki hızlı büyüme bariyer ve sonuçları yerinden çünkü bacak bölgesi aşamasında 10&#39;da Bu protokol muhtemelen bacak tomurcuk aşamalarında ötesinde gen ifadesinin çalışma için uygun değildir sadece bir engel oluşturma başlangıç ​​konumuna geçirilmesi ile ilgilidir. Bu bağlamda civciv embriyo sınırlamaları ile ilgili olması, diğer omurgalı model organizmalar üzerinde avantajları çoktur. civciv embriyo omurgalı bir embriyo fiziksel müdahale bu tür için çok uygun bir hayvan modeli. Embriyolar, nispeten büyük ve Throu kolayca erişilebiliryumurta kabuğu gh. Bir başka deney için embriyo dönebilirsiniz (örneğin, bir boncuk 18 ya da bir bariyer çıkarılması) veya basitçe bant pencere kaldırarak gidişatını kontrol etmek için. Canlı görüntüleme veya zaman atlamalı görüntüleme dahil etmek mümkün kapsamı vardır. Biz özellikle erken evre embriyolar üzerinde çalışan için uygundur tavuk yumurtası Pencereleme bir yöntem açıklanmaktadır. ekstremite çalışmaları durumda her bir biyolojik deney için ideal bir iç kontrol olarak hizmet vermektedir her deney için bir kontralateral kontrol uzuv olduğunu çok önemli ve yararlı olduğunu. sinyal moleküllerinin batırılmış uzuv akıbet ve boncuk önlemek için geçirimsiz bariyerler kullanarak kombinasyonu daha önce rapor edilmemiştir. Bu tür müdahaleleri aşağıdaki mRNA Bizim analizi de romandır. Bu teknikler uzuv özel transkripsiyon Tbx5 ve Tbx4 de LPM uyarılan ve olan faktörleri ne zaman zor bir problemi incelemek için etkinDaha sonra, önceden tomurcuğu başlatılması uzuv olduğunu göstermek için, LPM bu tbx genlerin varlığı FGF10 transkripsiyon aktivasyonu ve bacak tomurcuk büyümesinin başlaması için yeterli değildir. 2G, 2D ve 2E iyi bu bulguları olarak göstermektedir. Şekil 2G aşamasında 10 bir bariyer sokulması şu Tbx4 ifade olmaması Tbx4 indüksiyonundan sonra, aşama 15 bariyer yerleştirilmesi, aşağıdaki 2D ve 2E varlığını taban tabana zıttır. RA batırılmış boncuklar implantasyon bariyer yerleştirilmesi ve bacak tomurcuk akıbet başlamadan önce LPM gerekli olan Somitlerin gelen RA kadar puan aşağıdaki ekstremite tomurcuğu başlatılması kurtarılmasını kolaylaştırdı. Bu tür teknikler uzuv gelişiminde başka sorular değil, aynı zamanda omurgalı embriyogenez diğer soruları çözmek için kullanılabilir. beyin, göz ve gövde alanları uygun olması muhtemeldir.

Klasik embriyolog geleneksel embriyonik gelişimini kontrol mekanizmaları sorgulamak için fiziksel teknikler kullandı. 1960&#39;lar ve 1970&#39;lerde araştırmacılar embriyogenez sırasında endüktif sinyallerin önemini göstermek için gelişen embriyonun dokularında arasına eklenen geçirimsiz bariyerler kullanılan teknikleri geliştirdi. Bizim ilgi bacak tomurcuk akıbet önce hangi etkinliklerin omurgalı ekstremite gelişimi ve özellikle olduğunu. Örneğin, bir bariyer yerleştirilmesi bu karşı, ameliyat edilmemiş tarafta normal olarak devam etmesine izin verirken, civciv embriyo bir tarafında meydana gelen bacak tomurcuk büyümesini engelleyebilir. Bu engeller değişik yapmak için kullanılan maddeler; Örneğin, mika plakaları 1 ve tantal folyo 2. Bu engeller etkin bir Somitlerin gelen ekstremite tomurcuğu formları, paraxial mezodermden oluşan hangi yanal plaka mezoderm (LPM), ayrı. Cerrahi aşılama teknikleri bu yakın ilişki zekâ göstermekbacak tomurcuğu başlatılması LPM 3 4 meydana ise H Somitlerin gereklidir. 80&#39;li ve 90&#39;lı yıllarda gelişimsel biyologlar gelişimsel süreçleri kontrol altına alınmasında gerekli olan sinyal molekülleri yayılabilir keşfetti. Bu sinyal molekülleri ile ıslatılmış Boncuk embriyonun belirli bölgelerde implante ve embriyonik gelişim değişiklikler üretmek olabilir. Bir civciv embriyo içine implante ve rakamlardan 5 ayna görüntüsü çoğaltılması üretebilir Örneğin, iyon değişimi boncuklar tarafından alınan retinoik asit (RA) 24 saatlik bir süre içinde serbest bırakılır. FGF protein içeren heparin akrilik boncuk interlimb LPM 6 uzuv tomurcuk büyümesini başlatabilir. Daha yakın zamanlarda, fare ve balık genetiği (7 gözden) yeni bir dönemin içine omurgalı bacak başlama çalışma almış. bacak tomurcuk başlamadan önce Somitlerin RA mevcut LP tarafından gerekli olan temel yayılabilir sinyal olduğunu iyi kanıtlar bulunmaktadırM bacak tomurcuklanmayı başlatmak için. Biz ekstremite tomurcuğu başlama sefer LPM gen ifadesi üzerinde bariyer implantasyon etkisini incelemek için civciv embriyo erişilebilirliğini ve deneysel sağlamlık istismar etmek istedim. Bizim yöntemin bir roman uyarlaması bir engel birleştirmek olduğunu bariyer tarafından bloke edilmiş dışsal olarak tedarik aday endojen faktörler bariyer boncuk yerleştirme yanal ile eksenel dokulardan blok sinyaller. Aşağıdaki protokoller ekstremite tomurcuk indüksiyon ve inisiyasyon mekanizmalarını didiklemek için geliştirilmiş olanlardır. bacak tomurcuk başlatılması incelenmesi erken evre embriyolar kullanarak anlamına gelir. ilk derialtı iğne ile hava kesesi yoluyla albumin bazı kaldırarak birçok araştırmacı pencere tavuk yumurtası. sarısı üstüne yatıyor embriyo, daha sonra yumurta düşük yalan olur. Bu, elektroporasyon gibi teknikler, bir avantaj, ancak embriyo cerrahi manipülasyon isteniyorsa bir dezavantaj olabilir.Mümkün bir avantaj olarak biz yumurta açılışına yakın embriyoya sahip bulmak. Sorular omurgalı bacak tomurcuk indüksiyon ve başlatılmasını kontrol sinyalleri ile ilgili kalır ve aşağıdaki protokoller onlara hitap etmek uygundur. Biz daha erken bir aşamada 12 8 daha aşamada civciv bacak tomurcuk akıbet önlemek için engellerin yerleştirilmesi için bir protokol geliştirmek için ilk bulunmaktadır. Bu protokollerin değiştirilmiş versiyonları da primordium kaynaklı olmak için erişilebilir bir indükleyici doku bitişik yatıyor kökeni ve endüktif ipuçlarının zamanlaması diğer soruları kullanılabilir. embriyo bölgesi, ilgili bir gelişim aşamasında erişilebilir sunulmuştur, daha sonra bir engel çalışılan iki doku ve gelişme sonucu değişiklikler arasında yerleştirilebilir. Örnekler, karaciğer ya da böbrek indüksiyon beyin gelişimi eksen uzantısı ve muhtemelen organ gelişmesinde bulunabilir.

<table><tbody><tr><td>Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont strong forceps, type AA</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11210-10</td><td></td></tr><tr><td>Curved scissors with blades 2.5 cm long</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5&amp;nbsp;cm long</td><td>Fine Science Tools www.finescience.de</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>Steel pin, 0.2 mm wide</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Sharpening stone, square</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Clear tape, 50 mm x 66&amp;nbsp;m</td><td>www.5staroffice.com</td><td>295985</td><td></td></tr><tr><td>FGF4 protein</td><td></td><td></td><td>A gift from Cliff Tabin.</td></tr><tr><td>all-trans-retinoic acid</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>R2625-50MG</td><td>Remember to protect from light.</td></tr><tr><td>BMS 493</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>B6688-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade No. 15</td><td>www.swann-morton.com</td><td>cat no. 0105</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>153-7301</td><td>Beads for delivering protein.</td></tr><tr><td>AG1-X2 Ion exchange resin</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>140-1251</td><td>Beads for delivering RA or BMS 493.</td></tr><tr><td>Incubator for eggs</td><td>Memmert www.hce-uk.com</td><td>LAB128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>P6148-1KG</td><td>Harmful, irritant, corrosive.&amp;nbsp; Handle powder in fumehood with full protective clothing.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Gibco www.thermofisher.com</td><td>41965-039</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific webshop.fishersci.com</td><td>D/4121/PB08</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Binocular Microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica www.leica-microsystems.com</td><td>MZ6</td><td>Replaced by M60</td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>Henry Stewart &amp;amp; Co Ltd sales@medeggs.com</td><td></td><td>Brown Eggs</td></tr></tbody></table>

application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick

civciv embriyo doğrudan bir şekilde gelişim soruları incelemek için kullanılabilecek mükemmel bir omurgalı bir model sağlar. cerrahi girişim sonrasında erişilebilirlik ve sağlamlık önemli deneysel güçlü vardır. Mika levhalar civciv bacak tomurcuk başlamasını 1 önlemek için kullanılan ilk engelleri vardı. kanat tomurcuk veya bacak tomurcuk indüksiyon ve ya başlatılması için geçirimsiz bir bariyer olarak alüminyum folyo kullanmak Protokoller tarif edilmektedir. Biz bariyer tarafından engellendi arz aday endojen faktörlerin dışsal olarak bariyere boncuk yerleştirme yanal ile bu tekniği birleştirir. Sonuçlar daha sonra gen ekspresyonu, in situ hibridizasyon ile analiz edilmiştir. Ana odak indüksiyon retinoik asit sinyalizasyon ve civciv embriyo ön ve hindlimb sonraki başlatılması rolüdür. Bu BMS 493 kullanımı (retinoik asit reseptörleri bir ters agonist (RAR)) yan levha mezoderm (LPM) implante batırılmış boncuklar bir bar etkisini taklit etmek içinrier Somitlerin (retinoik asit kaynağıyla (RA)) ve ekstremite tomurcukları büyümesi olan LPM arasına yerleştirilir. Bu protokollerin değiştirilmiş versiyonları da endüktif ipuçları kökeni ve zamanlaması konusunda diğer soruları kullanılabilir. civciv embriyo bölgesi, ilgili bir gelişim aşamasında erişilebilir sunulmuştur, bir engel çalışılan iki doku ve gelişme sonucu değişiklikler arasında yerleştirilebilir. Örnekler, karaciğer ya da böbrek indüksiyon gibi gelişmekte olan beyin, ekseni uzantısında ve organ gelişiminde bulunabilir.

Yukarıda detaylı bir protokol Nishimoto ve arkadaşları kullanılan yöntemleri tarif eder. 2015 kağıt ön ve civciv embriyo hindlimb hem de bacak tomurcuk indüksiyon ve başlatılması inceler. Ön ayakları tomurcuk akıbet önlemek için geçirimsiz engellerin yerleştirilmesi aşağıdaki sonuçlar önceden 1, 2, 9 yayınlanmış ancak bacak tomurcuk başlatılması 1 önlenmesi sadece bir çalışma açıklayan engeller olmuştur. Nishimoto ve ark arka bacak verileri. 2015 bariyer yerleştirme aşağıdaki mRNA ifadesinin çalışmanın temsilcisi sonuçları burada sunulmuştur. LPM içinde Tbx4 İfade Arka ayağın akıbet başlatın için yeterli değildir: Şekiller 2B ve C (Tablo 2) aşama 15 (Şekil 2A) o bariyer yerleştirilmesini gösteren iki FGF10 yol açar (protokol 3.2)ve FGF8 ifade işletilen sağ tarafta (braket ile gösterilen) bacak tomurcuk bölgede yok olma. Opere sol tarafı ile karşılaştırın. Ancak, Tbx4 ifade işletilen tarafında (Şekil 2B ve E) hem sahnede 19 ve evre 23&#39;te görülmektedir. Biz yalnız Tbx4 ifade LPM hindlimb akıbet başlatmak için yeterli değildir sonucuna varıldı. Civciv diğer çalışmalar TBX gen ön ayakları tomurcuk oluşumu 12, 13 başlatmak için yeterli olduğunu ileri sürmüşlerdir. Şekil 2C &#39;bir engel embriyo sonrası fiksasyon bacak bölgesinde ankastre görünüyor nasıl göstermek için dahil edilmiştir. Vakalar engellerin çoğunda önceden in situ hibridizasyon (protokol 4.3) &#39;de çıkarıldı. Somitlerin RA FGF10 İndükler Ekstremite Bud O önce LPM içinde Essentialutgrowth: Şekil 3A, 15 sahne (protokol 3.2.1.3) eklenen bir bariyere RA batırılmış kordon distal eklenmesini temsil eden bir şemadır. (Bir yıldız işareti ile belirtilmiştir) bu işlem bacak tomurcuk büyümesinin da kontrol sol tarafında olduğu gibi tomurcuk olarak ifade edilmiştir ameliyat sağ tarafta Tbx4, FGF10 ve FGF8 gözlenmektedir takiben (Şekil 3B, C ve D, Tablo 2) . Böylece LPM için RA eklenmesi bariyer ve bacak tomurcuğu başlatılması ilerledikçe etkisini ortadan kaldırır. Biz ekstremite tomurcuk akıbet başlatılabilir önce Somitlerin normal gelişim RA&#39;da LPM gerekli olduğu sonucuna varıldı. Ortaya çıkan hindlimb tomurcukları kontrol tarafında olanlar genellikle daha küçüktür. Bu LPM yabani tip duruma denk olmama RA dozuna bağlı olabilir. RA dozu çok yüksek ise Apikal Ektodermal Ridge (AER) kısaltılabilir ve küçük tomurcukları neden olur14, 15. LPM içinde (Somitlerin itibaren) o RA doğrulamak için normal bir uzuv tomurcuk başlatılması RAR, BMS 493 ters agonist için gereklidir, kullanılmıştır. Boncuk aşamada 15 bacak bölge LPM implante edilir (Şekil 3E) (protokol 3.2.1.4 bakınız). FGF10 ifade kontrol tarafı (; Tablo 3 Şekil 3F) ile karşılaştırıldığında daha küçük hindlimb tomurcukları sonuçlanan 493 boncuk LPM içinde BMS aşağıdaki uygulama downregüle olmaktadır. Kontrol DMSO boncuklar bu hataları (; Tablo 3 Şekil 3G ve 3H) neden olmaz. BMS 493 Uygulamayı takip eden gözlenen kusurlar bir engel operasyonu ile uyarılan daha hafif olan; yani FGF10 hala ifade edilir ve bacak tomurcukları oluşur. BMS 493 etkileri boncuk etrafında yerel sınırlıdır ve axi tarafından üretilen tüm RA antagonize mümkün olmayabilir, çünkü bu olması muhtemeldirark dokular. Erken Eksenel Sinyaller sonra Tbx4 Express LPM Hücreleri belirtin: LPM muhtemel bacak oluşturan bölgede Tbx4 ifade kabiliyetini kazanır Biz test ettik. bir engel daha sonra bacak tomurcuk akıbet bloke edeceği eklenebilir en erken evre, sahnede daha erken aşamalarında paraxial mezoderm ve olası bacak arasına yerleştirilen 12. Engelleri engelleri eklemek için bir protokol geliştirmek için ilk olan aşama 10&#39;dur aşama 10&#39;da LPM aşamasında 10 eksenel dokulardan gelen bir sinyal daha sonra ekspresyon için gerekli olduğunu göstermektedir, blok bacak tomurcuk oluşumu ve bacak oluşturucu LPM bölgesindeki Tbx4 ekspresyonunu (Şekiller 2F ve 2G, Tablo 2) (protokol 3.4) hindlimb LPM içinde Tbx4. Daha sonra bariyer yerleştirme Tbx4 ifade veriyor Şekil 2D ve E bu sonuç karşılaştırkurulacak. Ayrıca, biz bu eksen sinyali RAR ters agonist Tbx4 ifadesini azaltır olmadığını gözlemleyerek RA olup olamayacağını test ettik. Evre 10 (protokol 3.4.1.3 bakınız) hindlimb LPM yerleştirilen bir BMS 493 boncuk DMSO batırılmış kontrol boncuklar Tbx4 ifade (Şekil 2J ve 2K) etkilemez oysa, Tbx4 ifadesini (Şekil 2H ve 2I) downregüle. Birlikte, bu sonuçlar eksenel dokulardan RA sinyali olumlu hindlimb LPM 7 Tbx4 düzenleyerek uzuv indüksiyon düzenleyen bir model destekler. Post-operatif Ölüm: Tablo 1, 2 ve 3 ameliyat sonrası ve hasat önce ölen civciv embriyo sayısı da dahil olmak üzere deneysel sonuçların ayrıntılı bilgi veriniz. Bazı ölümler bu tür mikrocerrahi sonra beklenemez. sayılar ölen tutulabilir<html> araçlar temiz olduğundan emin yaparak asgariye, yumurta delik embriyolar bu son nokta operasyonu ile birlikte, asgari süre için yapışkan bant mühür koruması olmadan sol ve olduğunu, minimum boyutu gerekli olan mümkün olduğu kadar hızlı bir şekilde gerçekleştirilir. Bu operasyonların hiçbiri çok zaman alıcı ama boncuk ve engellerin ilgili işlemler biraz daha zaman alabilir vardır. Bu önlemlere rağmen, operasyon erken bir evrede de gerçekleştirilebilir ve kanat bölgesinde, bu ölümüne neden olması muhtemeldir. ölüm nedeniyle kan kaybına yol açabilir bacak oluşturan bölgeler ve bu gemilerin kazayla rüptürü etrafında büyük kan damarları vardır. Biz yumurta olan embriyolar ameliyat değil, sık sık ertesi gün ölecek evre 8 ya da 9, açılan bulabilirsiniz. Bu nedenle, bu sorunlar tek çözüm deneyler yüksek dizi deneyi gerçekleştirmek üzere olan. d / 54618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; Muhtemel Bacak Düzeyde Bariyer veya Boncuk Ekleme aşağıdaki Şekil 2. Marker Gen İfadesi değişiklikler. (A) aşama 15 embriyoda olası bacak seviyesi (Somitlerin 26-32) de şematik gösteren bariyer pozisyonu (yeşil hat). (B - E ve G) işletilen embriyolar üzerinde DİLERİZ analizi. Bacak bölgesi (parantez) belirtilmiştir. (B) FGF10 ifade işletilen LPM eksik olan, fakat sağlam bir sentezleme sol tomurcuk tespit edilir. (C) FGF8 ifadesi hiçbir AER olduğunu düşündüren, ameliyat tarafı yoktur. (C &#39;) bir bariyer çıkarılmadan önce, aynı embriyosu. (D) Tbx4 kontrol tomurcuk aynı Rostro-kaudal düzeyde LPM olarak ifade edilir. (E) Tbx4 ifade ekstremite büyüme olmamasına rağmen sağ bacak bölgesinde tutulur. (F) bir sahnenin şematik<html> varsayımsal bacak seviyesinde bariyer pozisyonu (yeşil hat) gösteren 10 civciv embriyosu. (G) Tbx4 ifade işletilen sağ LPM (braket) &#39;de yoktur. (H) olası bacak seviyesinde BMS 493 boncuk pozisyonu (mor daire) gösteren bir sahne 10 civciv embriyo şematik diyagramı. (I) Tbx4 ifade BMS 493. (J) kontrol DMSO boncuk pozisyonu (gri daire) gösteren bir sahne 10 civciv embriyo şematik diyagram ile tedaviyi takiben ameliyat sağ tarafında downregüle olmaktadır. (K) Tbx4, tek başına DMSO ile işleme tabi kontrolü sol tarafının edilene benzer bir düzeyde çalışan yandaki ifade edilir. Bu şekil 7 ile modifiye edilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> d / 54618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3. RA kurtarır Ekstremite Bud&#39;un Devamsızlık Bariyer Ekleme Yarattığı ve Bacak Bud kıbet öncesinde LPM Essential olduğunu. (A) olası bacak seviyesinde (Somitlerin 26-32) ve RA-batırılmış boncuk (kırmızı daire) bariyer konumunu (yeşil hat) gösteren şematik diyagram. (B - D) (bir yıldızla gösterilir) RA kurtarır bacak tomurcuk sonucudur. (B) Tbx4 ifade un çalışan tarafına benzer kurtarıldı bacak tomurcuk halinde mevcuttur. (C) FGF10 kurtarıldı bacak un çalışan tarafına benzer tomurcuğun ifade edilir. (D) FGF8 kurtarıldı sağ bacak tomurcuk AER olarak ifade edilir. BMS 493 boncuk (mor halkalar) evre 15 embriyo olası bacak LPM yerleştirildi nerede (E) şematik göstermektedir. (F) FGF10 ifade çalışan sağ tarafta downregüle ve bacak tomurcuk küçük aşağıdaki BMS 49 mesafesindedir3 tedavi. Boncuk üst yıldızlı vardır. Kontrol DMSO boncuklar (gri daireler) konumunu gösteren (E) ila (G) &#39;dekine benzer şematik. (Yıldız ile gösterilen) (H) DMSO boncuk FGF10 ifade ya da bacak tomurcuk büyüklüğü etkilemedi. Bu şekil 7 ile modifiye edilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sahne bariyer yerleştirilmiş (+ boncuk) * </td><td> sayı işletilen </td><td> Kanat eksik ** </td><td> Kanat mevcut ** </td><td> sayı ölü </td></tr><tr><td> Aşama 12-14 </td><td> 40 </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Aşama 8/9 </td><td> 65 </td><td> 23 </td><td> 0 </td><td> 42 </td></tr><tr><td> Aşama 12-13 (FGF4 boncuk) </td><td> 41 </td><td> 7 (boncuk eksik) </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Aşama 12-13 (RA boncuk) </td><td> 75 </td><td> 9 (boncuk eksik) </td><td> 32 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> Aşama 13 (kontrol boncuk) </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="5"> * Somitlerin 15-20 ve yan plaka mezoderm arasına yerleştirilen 0,7-1 mm folyo engelleri. 0.35 mg / ml FGF4 kordon. 0.05-0.1 mg / ml RA kordon. </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSO kontrolü kordon. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** Chick embriyolar sabit aşamaları 21-23 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Kanat Seviye Bariyer ve Boncuk Deney Sonuçları. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sahne bariyer yerleştirilmiş (+ boncuk) * </td&gt; <td> sayı işletilen </td><td> Bacak eksik ** </td><td> Bacak mevcut ** </td><td> sayı ölü </td></tr><tr><td> Aşama 12-15 </td><td> 43 </td><td> 39 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Aşama 10/11 </td><td> 23 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Aşama 15 (FGF4 boncuk) </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Aşama 15 (RA boncuk) </td><td> 18 </td><td> 0 </td><td> 18 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * Somitlerin 26-32 ve yan plaka mezoderm arasına yerleştirilen 0,7-1,3 mm folyo engelleri. 0.35 mg / ml FGF4 kordon. 0.05-0.1 mg / ml RA kordon. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** Chick embriyolar sabit aşamaları 18-24 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Bacak Seviye Bariyer ve Boncuk Deney Sonuçları. <table border = &quot;1&quot; fo: keep-together.within sayfa = &quot;1&quot; fo: keep-ile-next.within sayfa = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> sayı işletilen </td><td> Bacak küçük tomurcuk </td><td> Bacak biraz küçük tomurcuk </td><td> Bacak tomurcuk normal boyut </td><td> sayı ölü </td></tr><tr><td> BMS 493 boncuk * </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 </td><td> 12 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> DMSO boncuklar ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 5 mg batırılmış 2-3 boncuk / ml BMS 493 bacak seviyesinde doğru aşama 14-15 LPM yerleştirilir. </td></tr><tr><td colspan="5"> DMSO batırılmış ** 2-3 boncuk yalnız bacak seviyesinde doğru aşama 15 LPM yerleştirilir. </td></tr><tr><td colspan="5"> Civciv embriyolar aşamalarında sabit 17-19. </td></tr></tbody></table> Tablo 3. Ayak Seviye BMS 493 Boncuk Deney Sonuçları.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick at JoVE.com

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Aday Faktörü Soaked Boncuk ile birlikte Geçirimsiz Engelleri Uygulama Chick Endüktif Sinyalleri Eğitim için

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

application-impermeable-barriers-combined-with-candidate-factor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K Görüntüleme.  King's College London, Guy's Campus. Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Video: Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Optimize<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Kalkınma Gelişmiş Aşamaları Chick Embriyolar ekimi

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Gelişim Biyolojisi

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Gen İfade Etkileyen Sinyal İletimi Pathways tanımak Tavuk Embriyo uzuvlar Geliştirme içine Boncuk eklenme

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

Erken Evre Tavuk Embriyolar Büyüme Faktörü-Kaplı Boncuk yerleştirme

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Biyoloji

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Uzun vadede bir Batık Filtre Kağıdı Sandviç<em&gt; Ex Ovo</emErken Civciv Embriyolar&gt; Time-lapse Görüntüleme

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Civciv Embriyo Sinir İndüksiyon için Testi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Nörobilim

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

Islatılmış Boncuk Tahlili Kullanılarak Tavuk Embriyogenezi Sırasında Hücre Farklılaşması, Morfogenez ve Desenleme Analizi

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Kraniofasial Geliştirme sırasında Ektodermal Epiteli Sinyal Özellikleri değerlendirilmesi

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Evaluation of Auditory Brainstem Response in Chicken Hatchlings

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ABRs in measuring auditory neural synchrony and estimating hearing sensitivity in other vertebrate model systems, methods for recording ABRs in the chicken have not been reported in nearly four decades. Chickens provide a robust animal research model because their auditory system is near functional maturation during late embryonic and early hatchling stages. We have demonstrated methods used to elicit one or two-channel ABR recordings using subdermal needle electrode arrays in chicken hatchlings. Regardless of electrode recording configuration (i.e., montage), ABR recordings included 3-4 positive-going peak waveforms within the first 6 ms of a suprathreshold click stimulus. Peak-to-trough waveform amplitudes ranged from 2-11 &#181;V at high-intensity levels, with positive peaks exhibiting expected latency-intensity functions (i.e., increase in latency as a function of decreased intensity). Standardized earphone position was critical for optimal recordings as loose skin can occlude the ear canal, and animal movement can dislodge the stimulus transducer. Peak amplitudes were smaller, and latencies were longer as animal body temperature lowered, supporting the need for maintaining physiological body temperature. For young hatchlings (&#60;3 h post-hatch day 1), thresholds were elevated by ~5 dB, peak latencies increased ~1-2 ms, and peak to trough amplitudes were decreased ~1 &#181;V compared to older hatchlings. This suggests a potential conductive-related issue (i.e., fluid in the middle ear cavity) and should be considered for young hatchlings. Overall, the ABR methods outlined here permit accurate and reproducible recording of in-vivo auditory function in chicken hatchlings that could be applied to different stages of development. Such findings are easily compared to human and mammalian models of hearing loss, aging, or other auditory-related manipulations.

We have used standard auditory brainstem response (ABR) techniques and applied them to hatchling chickens, a precocious avian model for auditory function. The protocol outlines animal preparation and ABR acquisition techniques in detail, with steps that could translate to other avian or rodent models.

Tavuk Yavrularında İşitsel Beyin Sapı Yanıtının Değerlendirilmesi

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ...

Aday Faktörü Soaked Boncuk ile birlikte Geçirimsiz Engelleri Uygulama Chick Endüktif Sinyalleri Eğitim için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Optimize