Jelleştirme protokolü, bir çalıştırmayı başlatmak için gereken süreyi ve adımları azaltan kullanıma hazır qPCR reaksiyonları üretir. Bu protokol, qPCR reaksiyonlarının aynı anda kalite ve büyük miktarlarda üretilmesini ve kontrol edilmesini sağlayarak reçete hesaplamaları sırasında operatör hatası olasılığını azaltır veya kuyulara. Bu yöntem, geleneksel dondurulmuş formatta zaten tamamen optimize edilmiş herhangi bir qPCR'ye uygulanabilir.
Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir, çünkü ana kalite kontrol adımlarından ikisi görseldir. Melezitoz çözeltisini hazırlamak için, 15 mililitrelik plastik bir tüpte dört gram melezitozu tartın, altı mililitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve toz çözünene kadar maksimum hızda vorteks yapın. Son hacmi nükleaz içermeyen suyla 10 mililitreye çıkarın, ardından çözeltiyi altı aya kadar iki ila sekiz santigrat derecede etiketleyin ve saklayın.
Trehaloz çözeltisini hazırlamak için, 15 mililitrelik plastik bir tüpte dört gram trehaloz tartın, toz çözünene kadar maksimum hızda altı mililitre nükleaz içermeyen su ve vorteks ekleyin. Daha sonra nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 mililitreye kadar yükseltin ve çözeltiyi 0.2 mikronluk bir filtreden süzün. Çözeltiyi altı aya kadar iki ila sekiz santigrat derecede etiketleyin ve saklayın.
Glikojen çözeltisini hazırlamak için, 15 mililitrelik bir tüpte iki gram glikojen tartın, altı mililitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve toz çözünene kadar vorteks yapın. Çözeltiyi sekiz ila 12 saat boyunca iki ila sekiz santigrat derecede tutun, çünkü glikojen çözünmesi çok sayıda kabarcık üretir. Ertesi gün, çözeltiyi inkübasyondan çıkararak, nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 mililitreye kadar oluşturun ve etiketli çözeltiyi altı aya kadar iki ila sekiz santigrat derecede saklayın.
Lizin çözeltisini hazırlamak için, 15 mililitrelik bir tüpte 7.5 miligram lizin tartın, altı mililitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve toz çözünene kadar vorteks yapın. Nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 mililitreye kadar yapın. Çözeltiyi 0,2 mikronluk bir filtreden süzün ve altı aya kadar iki ila sekiz santigrat derecede saklayın.
Jelifikasyon karışımını hazırlamak için, uygun hacimlerde stok çözeltilerini 50 mililitrelik bir plastik tüp içinde karıştırın. Tüpü 10 kez ters çevirerek reaktifleri karıştırın ve etiketli çözeltiyi üç aya kadar iki ila sekiz santigrat derecede saklayın. qPCR ana karışımını jelifikasyona hazırlamak için, reaktifleri soğutulmuş bir kapta çözün.
Daha sonra, sekiz tüp şeridi veya 96 kuyucuklu bir plaka için yeterli ana karışım hazırlamak için reaktiflerin uygun hacimlerini 1,5 mililitrelik bir tüpte karıştırın. Bir sonraki pipet 18.5 mikrolitre jelifikasyon ana her reaksiyon kuyusuna karışır ve tüpleri veya plakayı vakum fırınının içindeki ısı iletken desteğine yerleştirin. 96 kuyucuk plakası kullanıyorsanız, su emilimi için her iki 96 kuyu plakası için fırına bir bentonit kil torbası yerleştirin.
Döngü tamamlandığında, hacmin gözle görülür şekilde yaklaşık beş mikrolitreye düşürülmesini ve sıvıların tüplere veya plakalara parmaklarla dokunulduğunda hareket etmemesini sağlayarak tüplerin veya plakaların uygun jelifikasyonu için tüpleri veya plakaları kontrol edin. Tüpleri veya plakaları kullanımdan önce sekiz ila 12 saat boyunca iki ila sekiz santigrat derecede kapatın ve saklayın. Jelleştirilmiş qPCR'yi kullanmak için, tüp şeridini veya plakasını buzdolabından çıkarın ve numune manipülasyonu için bir iş istasyonunda açın.
Her reaksiyon kabına 15 mikrolitre nükleaz içermeyen su ve beş mikrolitre DNA örneği ekleyin. Tüpleri veya plakaları kapatın, istediğiniz deneyi çalıştırın ve düzenli veri analizi yapın. Mevcut protokolde, odanın içindeki sıcaklık 30 santigrat derecede sabit tutulurken, basınç 910 ila 930 milibar arasında ve vakuma yakın arasında değişmektedir.
Vakum döngüsünden sonra, tüpün içindeki ana karışım hacim olarak azalır, altta jelleşir ve tüplere dokunulduğunda duvarlara sıçramaz. Jelleşme eksikse, tüplere dokunulduğunda sıvı tüp duvarlarına sıçrar. Yayınlanmış oligonükleotid dizileri kullanılarak yapılan tripanosoma cruzi-DNA tespiti burada gösterilmiştir.
Jelifikasyon doğru şekilde gerçekleştirilmediğinde aynı numunenin algılanması, hassasiyet kaybına neden oldu. En kritik adım, jelifikasyondan önce reaktif hacminin hesaplanmasıdır. Operatör, işlem sırasında çıkarılacağı için su eklememeyi hatırlamalıdır.
Protokol adımları yakından takip edilirse, temel laboratuvar ve moleküler biyoloji becerilerine sahip operatörler jelleştirme işlemini gerçekleştirirken zorluk çekmeyecektir.
