Bu murine ekstrahepatik safra yolu organoid sistemi preklinik kolanjiyopati modellerive pluripotent kök hücre ve karaciğer kaynaklı kolanjiyosit organoid modellerin sınırlamaları sınırlı erişim adresi olabilir. Modelimiz erişkin dokuya özgü, indirgemeci, tekrarlanabilir, zaman ve maliyet etkindir. İnsan dokularına erişimi olmayan laboratuvarlar için özel bir fayda sağlayacaktır.
Tekniğimiz doku rejenerasyonu ve hücre-hücre etkileşimleri çalışma ekstrahepatik safra yolu kolanjiyositneredeyse sınırsız sayıda kültürsağlar. Prosedürü gösteren Junya Shiota, benim laboratuvarımdan bir post-doc olacaktır. İntrahepatik safra yolu izolasyonu için yetişkin fareyi supine pozisyonda yerleştirin ve orta hat boyunca karın boşluğunu açın.
Diyafram dinlenmek için karaciğer geri çekin ve yavaşça karaciğer hilum hemen altında ortak safra kanalı ortaya çıkarmak için proksimal duodenum çekmek için bir hemostat kullanın. Ekstrahepatik safra kanalını çevre dokulardan ayırmak için neşter kullanın. Forceps ile ortak safra kanalının proksimal ucunu tutarak, karaciğerden kanalın proksimal ucunu kesmeden önce duodenum ile kavşak hemen üzerinde distal kanal incelemek.
İzole ekstrahepatik safra kanalını hemen buz üzerinde soğuk yıkama tamponu içeren bir cam plakaya yerleştirin, ardından safra kanalını çevredeki dokudan temizleyin ve 0,5 milimetrelik bölümlere doğun. Tüm doku lar doğrlandığında, bölümleri 37 santigrat derecede 20 dakikalık bir kuluçka için 500 mikrolitre dissociation tamponiçeren bir tüpe aktarın. Dissociation sonunda, buz gibi hücre kültürü orta 500 mikrolitre ile tampon nötralize ve 18-gauge iğne ile doku süspansiyon 20 kez triturate ve daha sonra 20-gauge iğne ile 20 kez.
Daha sonra ortaya çıkan hücre süspansiyonuna 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Bir safra organoid kültür kurmak için, santrifüj ile hücreleri toplamak ve dikkatle supernatant kaldırın. Bir mililitre buz gibi, steril PBS'deki peleti yeniden askıya alın ve ikinci bir santrifüj için hücreleri 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Yıkanmış peleti 120 mikrolitre likit, buz gibi bodrum matrisinde ve plaka 40 mikrolitre hücreyi 37 derece ısıtılmış, 24 kuyuluk üç kuyunun ortasına yerleştirin ve plakayı yaklaşık 15 dakika boyunca 37 derece santigrat doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Bodrum matrisi katılaşmış olduğunda, tabağı kuvöze geri vermeden önce her kuyuya 600 mikrolitre 37 santigrat derece lik tohumlama ortamı ekleyin. Üç gün ve bundan sonraki üç günde bir, tohumlama ortamını 600 mikrolitre taze organoid kültür ortamı ile değiştirin ve organoid büyümeyi ters bir mikroskopla düzenli olarak izleyin.
Ekstrahepatik safra kanalı kültürlerini aktarmak için, pipet her kuyudaki organoidleri 400 mikrolitre buz gibi PBS ile 10 kez ayrı ayrı 1,5 mililitrelik tüplere aktarmadan önce. Organoidleri birbirinden ayırıp hücreleri santrifüjle toplamak için her karışımı dört kez 25 kalibrelik bir iğneden geçirin. Daha sonra yeniden kaplama için uygun oranda bodrum matris hücreleri resuspend.
Uzun süreli ekstrahepatik safra kanalı organoid depolama için, bodrum matris damlarahatsız etmeden oda sıcaklığında PBS ile organoidlerin her kuyu yıkama ve her kuyuya buz gibi dondurma orta 500 mikrolitre ekleyin. Organoidleri yavaşça askıya alın ve karışımı tek tek kriyojenik şişelere aktarın, ardından viritleri buhar fazında uzun süreli depolama için bir azot tankına aktarmadan önce 48 saat boyunca eksi 80 dereceye yerleştirin. Parafin gömme için organoidler hazırlamak için, dört santigrat derece PBS 500 mikrolitre ile orta değiştirin ve sıvılaştırılmış bodrum matris içeren tek tek 1.5 mililitrelik tüpler içine her kuyudan süspansiyon aktarın.
Santrifüj ile organoidler toplamak ve pelet rahatsız etmeden dikkatle supernatants kaldırmak için değiştirilmiş bir P1000 pipet ucu kullanın. Sonra dört santigrat derecede bir gecede kuluçka için organoidlere bir mililitre buz gibi, %4 paraformaldehit ekleyin. Ertesi sabah, oda sıcaklığında beş dakikalık bir kuluçka için oda sıcaklığında bir mililitre PBS ile fiksatif değiştirin ve üç kez santrifüj ile organoidler yıkayın.
Son yıkamadan sonra, organoidleri oda sıcaklığında beş dakikalık bir kuluçka için %30 etanol mililitresinde yeniden askıya alın ve ardından oda sıcaklığında %70 etanolün mililitresinde beş dakikalık bir kuluçka. %70 etanol inkübatasyonunun sonunda, organoidleri santrifüj le toplayın ve organoidleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca %100 etanolün bir mililitresinde yeniden askıya alın. % 100 etanol kuluçka sonunda, ısı numunesi işleme jeli bir mikrodalga 20 saniye veya sıvılaştırılmış kadar, ve organoidlerin her tüp için sıvılaştırılmış jel 50 mikrolitre ekleyin.
Numune işleme jeli katılaştırılanıncaya kadar tüpleri buzüzerine yerleştirin ve parafin katıştırma da daha fazla işleme için bir kaset mavi sünger yastıkları arasında her tüp organoidlerin damla transfer. Kaseti adım başına 15 dakika programlanmış bir doku işlemcisine yerleştirin, ardından parafinle gömülü organoidleri, standart protokollere göre immünohistokimyasal boyama ve analiz için kesit başına dört mikrometrelik numune işleme jeline bölün. Ekstrahepatik safra yolu organoid kaplama verimi yenidoğan veya erişkin farelerden izole edildiğinde yaklaşık %2'dir.
İkinci geçişten sonra, erişkin farelerden elde edilen ekstrahepatik safra yolu organoidlerinin kaplama verimi %11'e yükselir ve sabit kalır. Organoidlerin çoğunluğu nadir düzensiz organoidler ile tüm pasajlar boyunca bir kistik morfoloji göstermektedir. Organoidler beş ila yedi gün içinde bir büyüme zirvesine ulaşırlar, bundan sonra intraluminal enkaz biriktirmeye başlarlar ve bozulurlar.
Bu nedenle, organoid kültürün bakımı için, organoidler her yedi ila 10 günde bir bölünmelidir. İmmünofluoresans ile analiz edildiğinde, ekstrahepatik safra yolu organoidleri E-kadherin ile işaretlenmiş saf epitel hücrelerinin oluşturduğu bir popülasyondan oluşur. Organoid hücreler ayrıca biliyer ata hücrelerinin belirteçlerinin yanı sıra biliyer farklılaşma belirteçlerini de gösterirler.
Daha da önemlisi, organoid hücrelerin yüksek bir yüzdesi asetiloid alfa Tubulin ile işaretlenmiş bir primer cilium sahip, hangi normal kolanjiyositbir özelliğidir ve uygun bir organoid hücre polarizasyonu öneriyor. Açıklanan sıcaklık durumuna yakın yapışma gereklidir. Titiz safra yolu diseksiyonu pankreas hücre kontaminasyonunu önler.
Santrifüj sonrası dikkatli manipülasyon ile hücresel malzeme kaybı önlenebilir. Bu organoidler preklinik modeller olarak kullanılabilir, genetik ve farmakolojik olarak manipüle, ya da ilaç ve enfeksiyöz ajanların etkilerini test etmek için kullanılır. Bu yöntem, kolanjiyosit biyolojisinin mekanizmalarını daha fazla incelemek için genetiği değiştirilmiş fare modellerinden yararlanmak isteyen laboratuvarlar tarafından kullanılabilir.
