Bu protokol, Ditylenchus dipsaci ile mücadele etmek için yeni nematisitlerin kültürleme tekniği ve orta verimli kimyasal elekler tarafından keşfedilmesini sağlar. Bu tekniğin basitliği, nematisidal potansiyele sahip bileşikleri tanımlamak için haftada binlerce bileşiğin taranmasına izin verir. Bu teknik, bitkilerin bitki-parazitik nematodlarını öldürmek için yeni bileşikler tanımlayabilir ve bu nedenle küresel gıda arzını artırabilir.
Başlamak için, litre başına 23 gram NA ve ultra saf su ile 500 mililitre besin agar veya NA ortamı hazırlayın. Steril tekniği kullanarak, 25 mililitre otoklavlanmış NA ortamını 20 adet tek kullanımlık 100 milimetre çapında, 15 milimetre derinliğinde Petri kabına dökün. Minimum organik madde ile litre başına 3.2 gram GA bazal ortam, litre başına 20 gram sakkaroz, litre agar başına 15 gram ve damıtılmış su içeren 500 mililitre Gamborg B5 veya GA ortamı hazırlayın.
Steril tekniği kullanarak, 10 tek kullanımlık Petri kabına 50 mililitre otoklavlanmış GA ortamı dökün. Tohum sterilizasyonunu gerçekleştirmek için, 150 bezelye tohumunu, bir laboratuvar tezgahındaki Bunsen brülör alevinin yakınında bir karıştırma çubuğuna sahip steril iki litrelik bir beherin içine dökün. Tohumlara 200 mililitre% 95 etanol ekleyin ve karıştırma plakasında beş dakika boyunca kuvvetlice karıştırın.
Ardından, etanol'ü bir atık kabına dökün. Tohumları tamamen batırmak için beherin içine çamaşır suyu çözeltisi dökün. Bir karıştırma plakasında 20 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın.
Ardından, çamaşır suyunu bir atık kabına dökün. Tohumları batırmak için beherin içine damıtılmış su dökün ve 20 dakika boyunca bir karıştırma tabağında kuvvetlice karıştırın. Son su yıkamadan sonra, sterilize edilmiş tohumları cam Petri kabına dökün.
Kirlenmeyi kontrol etmek için, sterilize forseps kullanarak laminer akış başlığındaki her 10 santimetrelik NA plakasına altı tohum aktarın. Tohumları plakanın çevresine yerleştirin. Plakaları ayrı ayrı laboratuvar sarma filmine sarın ve karanlıkta üç gün boyunca 26 santigrat derecede inkübe edin.
Laminer akışlı bir davlumbazda, sterilize forseps ile her GA plakasına kirlenmemiş iki tohum tabaklayın. Tohumların filizlenmesini sağlamak için oda sıcaklığında 7 ila 10 gün boyunca inkübe edin. Litre başına 50 mililitre 20 gram sakkaroz çözeltisi hazırlayın.
Filtre sakkaroz çözeltisini sterilize edin ve bir kenara koyun. Laminer bir akış başlığında, mevcut bir kültür plakasından kök dokusu içeren bir agar parçasını kesin. Pipet, bezelye fideleri ile yeni GA plakasına 500 mikrolitre sakkaroz çözeltisi yerleştirin ve sakarozun üzerine bir agar küpü yerleştirin.
Kültürü, oda sıcaklığında alüminyum folyo ile kaplı bir kutuda tutun. Kültürü korumak için, nematodları her sekiz ila dokuz haftada bir taze GA plakaları üzerinde alt kültüre alın. Nematodlar yaklaşık sekiz hafta sonra ekstrakte edilmeye hazırdır.
Laminer bir akış başlığında, agar ve kök dokusunu steril bir neşterle bir santimetrelik küpler halinde kesin. Agar küplerini kahve filtresiyle kaplı huniye aktarın ve kahve filtresini nemlendirmek için yavaşça agar üzerine damıtılmış su dökün. Kahve filtresiyle kaplı huniyi beherden çıkarın ve kahve filtresiyle kaplı huni değiştirildikten sonra su seviyesi filtrenin dibine dokunana kadar beheri damıtılmış suyla doldurun.
Kahve filtresi kaplı huniyi ve beheri alüminyum folyo ile örtün. Solucanları toplamak için, kahve filtresiyle kaplı huniyi çıkarın ve yerleşmiş solucanları bozmadan, toplama kabından en üstteki 40 mililitre suyu aspire edin. Kalan sıvıyı 10 mililitrelik plastik serolojik pipet ile 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne toplayın.
Tahlil plakalarını hazırlamak için, otoklav damıtılmış suyu steril bir oluğa dökün ve oluktan 40 mikrolitre damıtılmış suyu, çok kanallı pipetli düz tabanlı 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna dağıtın. 96 delikli kimyasal stok plakalarından, kimyasal plakaya üç kez sabitleyerek tahlil plakalarına kimyasallar ekleyin. Ardından, pimleri 10 kez tahlil plakasına aktarın.
Temizleme solüsyonunun önündeki kağıda dökün. Koleksiyondaki nematodların sayısını saymak için önce koleksiyonu yeniden askıya alın ve ardından düşük tutma uçlarını kullanarak çözeltinin beş mikrolitresini bir slayta pipetleyin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak beş mikrolitredeki nematodların sayısını sayın.
Daha sonra, steril, damıtılmış su kullanarak konsantrasyonu mikrolitre başına iki solucana ayarlayın. Daha sonra, çok kanallı pipet ve oluk ile 96 delikli plakaların her bir kuyucuğuna 10 mikrolitre numune ekleyin. Tabakları nemli bir kağıt havluyla sarın ve bir kutuya yerleştirin.
Ardından, plakaların minimum hareketini dengelemek ve sağlamak için ekstra nemli bir kağıt havlu ekleyin ve 200 RPM'ye ayarlanmış 20 santigrat derece sallama inkübatöründe yapışkan bir ped üzerine yapıştırın. Plakaları beşinci günde diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyin. DMSO solvent kontrollerindeki ve ilaçla tedavi edilen kuyulardaki mobil ve toplam D.dipsaci sayısını sayın.
Solucanlar hareketsizse, hareketi uyarmak için kuyuya 40 milimolar nihai konsantrasyona iki mikrolitre bir molar sodyum hidroksit ekleyin. Mobil solucanların oranını hesaplayın. D.dipsaci ekranlarında, tekrarlanabilir bir şekilde% 0 mobil solucan veren kuyular güçlü isabetler olarak kategorize edilir.
Üç farklı ilaç plakası, her ilaç plakasının üç biyolojik replikasyona sahip olduğu 60 mikromolar konsantrasyonda tarandı. Her üç plaka da DMSO-solvent kontrollerinin% 6'sını içeriyordu. Küçük molekül kütüphanesinden ilaç içeren birçok plaka, D.dipsaci'ye karşı gözlemlenebilir biyoaktiviteye sahip herhangi bir molekülden yoksundu.
Bazı plakalar tamamen tekrarlanabilir vuruşlara sahipken, karakterize nematisitler içeren diğerleri aktivitelerinde değişiklik gösterdi. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder. Burada, fluopyram tahlilde sağlam bir aktivite sergiledi.
Fluopyram, EC50 9.3-mikromolar ile D.dipsaci hareketliliği üzerinde belirgin bir doza bağımlı etkiye neden olmuştur. Oksamilin 120 mikromolar konsantrasyona kadar hareketlilik üzerinde önemli bir etkisi yoktu. Oksamil, 120-mikromolar konsantrasyonuna kadar hareketlilik üzerinde önemli bir etkiye sahip değildi.
Sodyum hidroksit ilavesi, hareketsiz solucanların tespitinde tahlil hassasiyetini arttırdı. 40 milimolar sodyum hidroksit, yetenekli bireylerde hareketi uyarmak ve böylece istirahat solucanlarını hasta solucanlardan ayırt etmek için tahlil bitiş noktası olarak kullanılmıştır. Bu protokol, bileşiklerin D.dipsaci ve diğer türlere karşı yeni etki mekanizmalarıyla tanımlanmasını sağlamıştır.
