Bu yöntem, genetik çeşitlilik panellerinde veya üreme popülasyonlarında bulunan fotokimyasal olmayan söndürmedeki genetik varyasyon hakkında bir fikir verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir gün içinde fotokimyasal olmayan söndürmedeki varyasyon için çok sayıda genotipi tarama potansiyelidir. Protokol, glisin max veya soya fasulyesi için sunulur, ancak kaldırma disklerinin toplanabileceği diğer bitki alanlarını analiz etmek için uyarlanabilir.
Protokolü ilk kez gerçekleştiren biri için anahtar, süngerlerin zarar görmesini veya suyla aşırı doygunluğa ulaşmasını önlemek için kaldırma diskini kullanmaktır. Başlamak için, çimlenmeden 30 gün sonra tarla sahasındaki bitkileri örnekleyin. 24 kuyucuklu bir plakanın tüm kuyularına 1/3 seviyeli damıtılmış su doldurun.
Kapağı ve plakanın yan tarafını örneklenecek replikalarla etiketleyin. Bitkinin tepesinde bulunan en genç tam genişletilmiş yaprağı bir lastik tıpasına karşı tutun. İki numaralı Humboldt mantar delicisine yaprağın içinden bastırın ve orta kaburgadan kaçınarak bir diski kesmek için bükün.
Teknik çoğaltmalar için aynı yapraktan art arda beş disk toplayın. Yaprak disklerini mantar deliciden bir pamuklu çubuk kullanarak 24 delikli bir plakanın tek bir kuyucuğuna itin ve bunu aynı genotipteki farklı bir bitki için tekrarlayın. Tüm yaprak disklerinin suda yüzdüğünü kontrol edin.
Değilse, bir kuyunun kenarına yapışan yaprak disklerini pamuklu çubukla yüzer bir konuma yavaşça hareket ettirin. Aşağıdaki grafikten örnekleme disklerine geçin. Kapağı yerleştirin ve yarı şeffaf esnek bir filmle kapatın.
24 delikli plakanın tamamında örneklemeyi tamamladıktan sonra. Plakayı doğrudan güneş ışığından uzak bir torbada, kutuda veya boş soğutucuda saklayın. Temiz bir laboratuvar alanında, taşıma sırasında kapağa yapışmış yaprak diskleri yerinden çıkarmak için kapalı plakanın kapağına dokunun.
Filmi açın ve kapağı çıkarın. Bir yaprak diski, 24 delikli plakanın ilk konumundan, yaprak diski kuyunun dibinde düz bir şekilde aşağı bakacak şekilde taze bir 96 delikli plakaya aktarın. Bir burun aspiratörü filtresini ikiye bölün.
Elde edilen filtreyi yarıya kadar suya batırın ve fazla sıvıyı gidermek için bir kağıt havluya batırın. Nemi korumak için filtreyi yaprak diskli kuyuya yerleştirin. 24 delikli plakanın ilk konumundan ikinci bir yaprak disk alın ve 96 delikli plakanın bir sonraki mevcut konumuna yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
Suda üretilen burun filtresinin kalan yarısını batırın ve ikinci yaprak diskle kuyuya yerleştirmeden önce bir kağıt havluya batırın. Görüntüleme için plakayı karanlıkta yönlendirmeye yardımcı olması için sağ üst köşeyi bantlayın. Plakaları yarı şeffaf esnek bir filmle kapatın ve plakayı alüminyum folyoya sarın.
Arsa kimliklerini ve plaka kimliğini alüminyum folyo üzerine yazın. Fotokimyasal olmayan söndürmenin ilk iki aşamasının gevşemesi için plakaları karanlık bir kutuya veya dolaba en az 30 dakika yerleştirin. Fotokimyasal olmayan söndürmenin uzun süreli aşamaları ilgi çekiciyse, görüntülemeden önce bir saatlik uzun bir karanlık inkübasyon süresi kullanın.
96 delikli yeni bir plakanın her köşesine ve ortasına bir yaprak disk yerleştirerek analiz sırasında odaklanmak için ek bir kukla plaka hazırlayın. Yaprak disklerini önceki plakalarda olduğu gibi burun filtreleriyle sabitleyin, plakayı kapatın ve karanlıkta oda sıcaklığında ve% 50 bağıl nemde inkübe edin. Görüntüleyiciyi açın ve görüntüleme yazılımını açın.
PAM deneysel protokolündeki adımların girilmesi için bir pencere açmak üzere Ayarlar'a ve ardından Protokol'e tıklayın. Makalede verilen makinenin teknik özelliklerini belirleyin. Karanlık uyarlanmış fotosentezin maksimum kuantum verimliliğini ölçmek için doygun bir darbe ile başlayacak şekilde programı ayarlayarak 20 saniye sonra isimli kutunun içine bir gecikme yaşanır.
Darbe uygula kutusunu tıklatın ve Bu sayı başlıklı kutuya 1 girin. Darbe PPFD'sini 6, 152'ye, darbe uzunluğunu 800 milisaniyeye ayarlayın ve Tüm darbelerle F asal ve FM asal görüntüleri al kutusunu işaretleyin. Protokole ikinci bir adım eklemek için Sonra ekle'yi işaretleyin.
Gecikmeden sonra başlıklı kutuya 30 saniye girin. Ardından, Aktiniği değiştir seçeneğini seçin ve odaya ışık yoğunluğunu 50 PPFD olarak ayarlamak için Aktinik PPFD başlıklı kutuya 50 girin. Protokole yeni bir adım eklemek için Sonra ekle'yi tıklatın ve Gecikmeden sonra başlıklı kutuya 150 saniye girin.
Aktinik ışık 50 PPFD'de tutulurken darbe uygula'yı seçin ve ölçüm darbelerini her 150 saniyede bir arka arkaya dört kez uygulamak için Bu sayı başlıklı kutuya 4 girin. Protokolü istenen yere pcl dosyası olarak kaydetmeden önce her adım için gecikmeyi ve ışık yoğunluğunu makalede verilen değerlere göre ayarlayın. Işığı kapatın ve kukla plakayı numune aşamasına yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin, böylece yaprağın adaksiyal yüzeyi dedektöre doğru yukarı bakar ve sünger platforma doğru aşağı bakacak şekilde yerleştirilir.
Örnek sahne yüksekliğini, yaprak diskler cihazın tabanından 140 milimetre yukarıda olacak şekilde ayarlayın. Fotoğraf makinesini başlatmak için görüntüleyici kameraya ve donanım kamerasına bağlan/bağlantıyı kes simgesine tıklayın. Tabanında iki yeşil çizgi bulunan kırmızı renkli, iki taraflı bir ok simgesiyle temsil edilen odak floresan sembolünü tıklatın ve plakayı netlemeye getirmek için lensi ve pozlamayı ayarlayın.
Yanıp sönen ışığı kapatmak için odak floresan simgesini tekrar tıklayın. Karanlıkta çalışırken, sahte plakayı analiz edilecek plaka ile değiştirin. Sağ üst köşeyi yönlendirmek için kullanılan dış taraftaki bantla yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve harita görüntüsü kamera simgesini tıklayın.
Açılır penceredeki çubuk yeşil bölgeye yerleştirilene kadar diyafram açıklığını açarak veya kapatarak görüntü pozlamasını ayarlayın. Diyafram açıklığının her ayarlanmasından sonra, pozlama doğru şekilde ayarlanana ve cihaz bir görüntü çekene kadar Yeniden Dene düğmesini tıklatın. Resme sağ tıklayın ve arka plan sinyallerini engellemek için Görüntü yalıtımı uygula'yı seçin.
Odaklanmış yaprak alanı gri, arka plan mavi renkte görüntülenir. Görüntüyü sağ tıklatarak Görüntüyü değiştir açılır menüsünden histogram ve gama düzeyini ayarlayarak yalnızca yaprak diskleri içerecek alanı veya pikselleri seçin. Resme sağ tıklayın ve açık mavi vurgulanan alanları silmek için Yüksek ve düşük kesimleri sil'i seçin.
Resme sağ tıklayın ve son üç piksele dokunmayan pikselleri kaldırmak için Sapmaları sil'i seçin. Görüntüde izole adalar olarak görünen tüm alanlar ayrı ayrı analiz edilecek ve nihai veri çıktısına dahil edilecektir. Programı başlatmak için protokolü çalıştır simgesini tıklatın.
Ekranın alt kısmında, protokolün çalışması için ne kadar süre kaldığını bildiren bir zamanlayıcı görünecektir. Protokol bitene kadar bekleyin. Verileri igr dosyası olarak kaydetmek için Dosya ve Farklı Kaydet'i tıklatın.
Başka bir örnek plakaya başlamadan önce pencerenin sağ üst köşesindeki kırmızı çarpı işaretine tıklayarak pencereyi kapatın. Klorofil floresan verilerini dışa aktarmak için, görüntüleme yazılımında igr dosyasını açın ve gerekli tüm dosyaları içeren yeni bir klasör oluşturmak için Dosya'ya ve ardından Klasöre Aktar'a tıklayın. Tarlada yetiştirilen soya fasulyesinde fotokimyasal olmayan söndürmenin tipik bir ölçümü, yaprak diskleri saniyede metre başına 50 mikromollük düşük ışığa maruz kaldığında Fv / Fm'yi belirlemek için ilk doygunluk flaşından sonra, fotokimyasal olmayan söndürmenin birden az olduğunu göstermiştir.
Ayrıca, saniyede metre başına 2.000 mikromol yüksek ışığa aktarıldıktan sonra, fotokimyasal olmayan söndürme 15 dakika sonra maksimum dört değerine kadar artmıştır. Başarısız bir ölçüm, yüksek ışığa aktarıldıktan sonra fotokimyasal olmayan söndürmede minimum bir artış gösterdi. Görüntüleyici içindeki plakaların yönlendirilmesi ve yaprak disklerinin örneklenmesi ve kaplanması için açıkça tanımlanmış bir plan, verilerin doğru genotipe bağlanmasını sağlamak için çok önemlidir.
Bu protokol, kuraklık ve dökülme gibi çevresel değişkenlerin fotokimyasal olmayan söndürme üzerindeki etkisini ölçebilir veya mahsul modellerini hassaslaştırmak için farklı gölgelik seviyelerinde fotokimyasal olmayan söndürmeyi değerlendirebilir.
