Bu yöntemin amacı, düşük CO2 taraması kullanarak fotorespiratuar yoldaki mutantları tanımlamaktır. Düşük CO2'ye maruz kaldıktan sonra fotorespirasyonu bozan mutantları tanımlamak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemin bir avantajı, nispeten kısa sürede yapılabilecek fideler için yüksek verimli bir tarama olmasıdır.
Aşağıdaki bölümlerde tohum hazırlama ve sterilizasyonu, bitki büyümesi ve düşük CO2 arıtımı hakkında ayrıntılı bilgi verilecek, floresan görüntüleme sistemi yapılandırılacak, işlenmiş numunelerin kuantum verimi ölçülecek, temsili sonuçlar ve sonuçlar elde edilecektir. Tohum hazırlama ve sterilizasyon. Tohum hazırlama, tohum emdirme ve tohum sterilizasyonundan oluşur.
Tüm bu adımların steril koşulları korumak için laminer bir akış davlumbazında yapıldığına dikkat etmek önemlidir. Gerekli tüm malzemeler, reaktifler ve büyüme ortamı otoklavlanır. Kullanılan tohum hatları plgg1-1, abcb26 ve WT veya wild tipindedir.
Tohumları laminer bir akış başlığında steril suda emilir, daha sonra iki gün boyunca karanlıkta dört santigrat derecede tabakalaşır. Steril koşullar altında, hacimsel ağartıcı çözeltisine 10 mililitre% 50 hacim hazırlayın ve yaklaşık 20 mikrolitre Ara 20 ekleyin. Emilmiş tohumlardan suyu çıkarın, ardından mikrosantrifüj tüpüne bir mililitre çamaşır suyu çözeltisi ekleyin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
Ağartıcı çözeltisini bir pipetle çıkarın. Tohumları yeniden asmak için bir mililitre steril suda durulayın. Tohumlar dibe çöktükten sonra suyu çıkarın.
Tohumları steril% 0.1 agaroz çözeltisinde askıya alın. Tohum kaplaması için,% 1 MS vitamin içeren bazal orta plakalar ve% 1 agar test mutantlarının yetiştirilmesi için. 200 mikrolitrelik pipet ucunu tıraş bıçağı ile kesin.
Bir pipet kullanarak, her test mutantı veya genotipi için belirlenen kare ızgaranın ortasına bir tohum yerleştirin. Burada, birer birer santimetre ızgaralı kare bir plaka kullanılır. Bu, her fide arasında eşit mesafeyi korumaya ve daha sonra floresan görüntüleme ve analizinde önemli olacak olan üst üste binmeyi önlemeye yardımcı olur.
Tohumlar kaplandıktan sonra, sızdırmazlık sağlamak için kapağın etrafına cerrahi bant sarın, ardından büyüme odasına yerleştirin. Bitki büyümesi ve düşük CO2 arıtma. Bitkileri yedi ila dokuz gün boyunca 20 santigrat derecede sekiz saatlik bir ışık döngüsü altında saniyede metre kare başına 120 mikromol ve 18 santigrat derecede 16 saat karanlık altında yetiştirin.
Görüntüleme için yeterince büyük olup olmadıklarını belirlemek için altıncı günde bitkileri kontrol edin. Kaplamadan sonraki sekizinci günde, bitkileri düşük CO2'ye maruz bırakın. Arıtma tesislerini, 12 saat boyunca saniyede metrekare başına 200 mikromol ışık yoğunluğuna sahip büyüme odasındaki kapalı bir kutuya yerleştirin.
Düşük CO2 koşulu, kabın altına yerleştirilmiş 100 gram soda kireci bulunan hava geçirmez şeffaf bir kap kullanılarak inşa edilmiştir. Konteyner, kontrol ile aynı büyüme odasına yerleştirildi. Kontrol tesisleri, 12 saat boyunca ortam CO2'sinde saniyede metre kare başına 120 mikromolün altında kalacaktır.
Floresan görüntüleme sistemini yapılandırın. Floresan görüntüleme sisteminde kameranın altında ortalanmış bir test plakasını sabit bir mesafeye yerleştirin. Cihaz yazılımında, canlı pencereye gidin ve aktinik olmayan ölçüm flaşlarını açmak için Yanıp sönüyor kutusunu işaretleyin.
Tam ve keskin bir görüntü görene kadar yakınlaştırma ve odaklama araçlarına tıklayın. EL deklanşörünün değerini sıfıra ayarlayın ve 200 ila 500 dijital ünite aralığında bir floresan sinyali almak için hassasiyeti ayarlayın. Bir ışık ölçeri fotoğraf makinesi ayarlarını yapmak için kullanılan konuma yerleştirin.
Canlı pencerede, 800 milisaniye süren doygun bir nabız başlatmak için Süper kutusunu işaretleyin. Işık ölçer saniyede metrekare başına 6.000 ila 8.000 mikromol okuyana kadar Süper darbenin göreceli güç yüzdesini ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın. İşlenmiş numunelerin kuantum verimini ölçün.
İşlemden hemen sonra, karanlık adaptasyon için plakaları 15 dakika boyunca alüminyum folyo ile örtün. Darbe genliği modifiye edilmiş bir florometre ile fotosistem iki'nin kuantum verimini ölçmek için folyoyu çıkarın. Ardından fide plakasını doğrudan kameranın altına yerleştirin ve GitHub depomuzda bulunan kuantum verim protokolünü çalıştırın.
GitHub'dan Quantum Yield Protokolü'nü indirin. Klasör simgesine tıklayarak ve dosya konumuna giderek program dosyasını açmak için bir florometre yazılımı kullanın. Kırmızı yıldırım simgesine tıklayarak kuantum verim protokolünü çalıştırın.
Protokol tamamlandıktan sonra, analiz öncesi pencereye gidin. Plaka görüntüsündeki her fide için tüm pikselleri vurgulayarak plakayı ayrı fidelere bölün. Vurgulanan arka plan piksellerini kaldırmak için Arka Plan Hariç Tutma'yı tıklayın ve yalnızca fide alanını bırakın.
Plaka görüntüsündeki her fide için floresan verileri oluşturmak üzere analiz et'i tıklayın. Tüm plakalar arasında tutarlı minimum ve maksimum değerleri görüntülemek için floresan değer aralığını manuel olarak ayarlayın. Deneme sekmesinde, Dışa Aktar'ı ve ardından Sayısal'ı tıklayın.
Her fide için kuantum verimini içeren bir metin dosyası oluşturmak için Sayısal Ortalama'ya tıklayın. Metin dosyasını ve elektronik tabloyu analiz için açın. Hesap tablosu alan numarasını, piksellerin boyutunu, Fm, Ft, Fq ve QY'yi içerir. İlk olarak, alan numarasını karşılık gelen genotipe tanımlamamız gerekir, ister vahşi tip ister bir test mutantı olsun, Sonuçlar.
İşte vahşi türlerin ve test mutantlarının ortam ve düşük CO2 taramasından ham ve floresan görüntülerin plaka resimleri. Her plaka, kuantum verimi veya QY olarak karşılık gelen floresan okumalarıyla alan numarasına göre etiketlenir. Veriler bir metin dosyası olarak dışa aktarılır ve analiz için bir elektronik tabloda açılabilir. Vahşi türlerin ve mutantların karanlık uyarlanmış Fv / Fm kuantum verim verimlilikleri, kutu ve bıyık grafikleri ile görselleştirilir.
Vahşi tiplerin ve test mutantlarının istatistiksel farkını test etmek için, 0.05'ten düşük bir P değeri ile çift yönlü T-testi kullanılmıştır. Burada, tarama yöntemimizin verimliliğini kontrol etmek için azaltılmış kuantum verimi Fv / Fm ile fotorespiratuar mutant hattını bir test mutantı olarak kullanıyoruz. Sonuçlarımız, test mutantlarının vahşi türlere kıyasla önemli ölçüde daha düşük kuantum verim verimliliğine sahip olduğunu göstermektedir.
Bu, tarama yöntemimizin düşük CO2 taraması kullanarak fotorespiratuar mutantları tanımlayabildiğini göstermektedir. Sonuç. Bu protokolü kullanırken hatırlanması gereken önemli bir şey, Arabidopsis fidelerinin floresanı ölçecek kadar büyük olduğundan, ancak görüntüleme sırasında bitkilerin üst üste bineceği kadar büyük olmadığından emin olmaktır. Yaprak boyutunu ve yaprak açılarını tek tip tutmaya çalışmak için fideleri ilk gerçek yapraklar olarak görüntülemek tercih edilir.
Bu protokol, fideler için yüksek verimli bir tarama olarak kullanılabilir. Her plakanın görüntülenmesi nispeten hızlıdır ve günde 1.000'den fazla fideyi tarama potansiyeline sahiptir. Klorofil floresan analizi, fotorespirasyon verimliliğini korumak için önemli olan düşük CO2 taraması kullanarak fotorespiratuar mutantları tanımlamamızı sağladı.
Bu protokol Arabidopsis ile sınırlı değildir ve abiyotik stres yanıtı deneyleri için potansiyel kullanıma sahiptir.
