Bu protokol, fare modellerinde çeşitli bağlamlarda koroid pleksusların ve periferik bağışıklık hücrelerinin beynin düzenlenmesindeki rolü hakkındaki soruları ele almak için yararlı olabilir. Bu protokol, farelerin koroid pleksuslarındaki benzersiz bağışıklık hücresi popülasyonlarının derinlemesine nicel ve kalitatif analizine izin verir. Koroid pleksusların diseksiyonu, küçük boyutları ve şeffaf renkleri nedeniyle başlangıçta zor olabilir.
Öncelikle perfüze edilmemiş hayvanlar üzerinde pratik yapmanızı öneririz. Başlamak için, beyni bir C57 siyah altı fare sırt tarafından disseke edilmiş bir Petri kabına yerleştirin ve çanağı dürbün halkalarının hedeflerinin altına yerleştirin. Forseps kullanarak beyni yerinde tutarken, başka bir forseps çiftinin iki ucunu yarımküreler arasındaki orta çizgiden aşağıya yerleştirin.
Forsepsleri kullanarak, korteksi kallozum ve hipokampus ile septumdan uzağa çekin, lateral ventrikülü ve üçüncü ventrikülün bir kısmını açığa çıkarın. Lateral koroid pleksusu, lateral ventrikülü kaplayan ve her iki ucunda da parlayan uzun bir örtü olarak tanımlayın. Daha sonra iki ucu ince forseps kullanarak, lateral koroid pleksusunu toplayın.
Hipokampusun arka kıvrımı tarafından gizlenmiş üçgen arka kısmı toplamaya dikkat edin. Daha sonra, korteksi korpus kallozum ve kontralateral yarımkürenin hipokampüsü ile septumdan uzağa çekerek tüm üçüncü ventrikülü ve karşı lateral ventrikülü açığa çıkarın. İnce forseps kullanarak, granüler yüzey yönüne sahip kısa bir yapı olarak tanımlanan üçüncü koroid pleksusunu toplayın.
Sonra diğer lateral koroid pleksusunu toplayın. Daha sonra, forsepsin iki ucunu beyincik ve orta beyin arasına yerleştirin ve dördüncü ventrikülü ortaya çıkarmak için beyinciği pons ve medulladan ayırın. Daha sonra dördüncü koroid pleksusu, dördüncü ventrikülü lateral sağ uçtan sol uca beyincik ve medulla arasında sıralayan granüler bir yüzey yönüne sahip uzun bir küresel yapı olarak tanımlayın.
İnce forseps kullanarak, dördüncü koroid pleksusunu toplayın. Toplanan tüm koroid pleksusları kollajenaz IV ile inkübe ettikten sonra, ayrışmayı tamamlamak için yaklaşık 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra kollajenaz IV aktivitesini durdurmak için tüpü MACS tamponu ile 1,5 mililitreye doldurun.
Daha sonra, hücreleri santrifüj edin ve hücreleri 1,5 mililitre MACS tamponu ile yıkamadan önce süpernatantı atın. Uygun kompanzasyon boncuklarını ve antikor çözeltilerini ekledikten sonra, numuneleri 30 ila 45 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ederek ışığa maruz kalmaktan koruyun. Daha sonra tüpleri 1,5 mililitre MACS tamponu ile doldurun ve hücreleri ve kompanzasyon boncuklarını santrifüj edin.
Hücreleri yeniden askıya aldıktan ve boncukları 500 mikrolitre MACS tamponunda kompanzasyondan geçirdikten sonra, hücreleri 70 mikronluk bir süzgeçten süzün. Akış sitometresini ve yazılımı açtıktan sonra, boyuta göre hücreler için ileri saçılma alanı ve yan saçılma alanı ve kapıyı seçin. Ardından, ileri saçılma yüksekliğine karşı ileri dağılım alanına sahip tek hücreler için bir alt kapı oluşturun.
Ardından, DAPI pozitif hücrelerini dışlamak için DAPI ve ileri dağılım alanına sahip canlı hücreler için bir alt kapı oluşturun. Daha sonra CD45 pozitif bağışıklık hücreleri için CD45 ve ileri saçılma alanı ile bir kız kapısı oluşturun. Şimdi, CD45 pozitif hücrelerden bir kız kapısı oluşturun ve CD11b pozitif F480 pozitif ve CD11b pozitif F480 negatif popülasyonlarını tanımlamak için CD11b'ye karşı F480'i seçin.
Daha sonra CD11b pozitif F480 pozitif hücreler için bir alt kapı oluşturun ve hem CX3CR1 pozitif IA-IE pozitif kenarlıkla ilişkili makrofajları hem de CX3CR1 pozitif IA-IE negatif makrofajları tanımlamak için CX3CR1 ve IA-IE'yi seçin. Daha sonra, CD11b pozitif F480 pozitif CX3CR1 pozitif IA-IE negatif makrofajlar için bir alt kapı oluşturun ve CD11b yüksek F480 orta seviye CX3CR1 pozitif IA-IE negatif Kolmer epipleksus makrofajlarını ve CD11b pozitif F480 yüksek CX3CR1 pozitif IA-IE negatif sınırla ilişkili makrofajları tanımlamak için F480 ve CD11b'yi seçin. Daha sonra CD11b pozitif F480 negatif popülasyonundan, IA-IE'ye karşı Ly6C için kapı.
Hem IA-IE pozitif Ly6C negatif popülasyonunu hem de esas olarak monositlere veya nötrofillere karşılık gelen IA-IE negatif Ly6C pozitif hücrelerini seçin. Son olarak, CD11b pozitif F480 negatif IA-IE pozitif Ly6C negatif popülasyonu için bir alt kapı oluşturun ve CD11b'ye karşı CX3CR1'i seçin. Daha sonra hem CD11b yüksek CX3CR1 düşük hem de CD11b pozitif CX3CR1 negatif popülasyonlarını tanımlayın.
T-hücresi geçişi için, daha önce açıklandığı gibi DAPI pozitif hücrelerini hariç tuttuktan sonra, CD45 pozitif bağışıklık hücreleri için FSC-A'ya karşı CD45 pozitif bağışıklık hücreleri için bir kız kapısı oluşturun, ardından CD45 pozitif hücrelerden bir kız kapısı oluşturun ve CD11b'ye karşı TCR beta'yı seçin. Son olarak, TCR beta pozitif CD11b negatif popülasyonu için bir alt kapı oluşturun ve CD4'e karşı CD8a'yı seçin.
Hem CD8 negatif hem de CD4 pozitif T hücrelerini ve CD8 pozitif CD4 negatif T hücrelerini tanımlayın. Burada gösterilen akış sitometrisi analizleri, miyeloid ve T hücrelerinin ana alt kümelerini ve fare başına göreceli toplam sayılarını yüksek oranda tekrarlanabilir bir şekilde başarıyla ortaya koymuştur. Miyeloid hücrelerin akış sitometrisi analizi, koroid pleksusun CD11b pozitif CX3CR1 pozitif F480 yüksek kenarlıkla ilişkili makrofajlar tarafından doldurulduğunu ve koroid pleksustaki CD45 pozitif immün hücrelerin% 80'ini temsil ettiğini göstermektedir.
Kolmer epipleksus makrofajlarının CD11b yüksek F480 ara CX3CR1 pozitif IA-IE negatif popülasyonu da tanımlandı. CD11b pozitif F480 negatif immün hücreler arasında, Ly6C negatif IA-IE pozitif hücrelerin iki farklı popülasyonu karakterize edildi ve muhtemelen dendritik hücrelere karşılık geldi. T hücrelerinin analizi ve geçit stratejisi, CD45 pozitif CD11b negatif TCR beta pozitif hücrelerin minör popülasyonunun varlığını vurgulamıştır.
Bunlar arasında, fare başına yaklaşık 30-50 CD8 negatif CD4 pozitif ve CD8 pozitif CD4 negatif T hücresi, fizyolojik koşullar altında koroid pleksusa doldurdu. Perfüzyonun kalitesini kontrol etmek önemlidir, çünkü herhangi bir kan kontaminasyonu koroid pleksusun bağışıklık kompozisyonunu bulanıklaştırabilir. Bu yöntemi, toplu veya tek hücreli RNA dizilimi gibi daha ileri analizler için seçilen hücre popülasyonlarının sıralanması takip edebilir.
