Bu protokol, kromatin dinamiklerini incelemek, özellikle histon şaperonlarının moleküler fonksiyonunu araştırmak için DNA perdesi tekniğinin nasıl kullanıldığını gösterir. Yüksek verimli tek moleküllü görüntüleme tekniği DNA perdesi, toplu deneylerin sınırlamalarının üstesinden gelir ve Gerçek Zamanlı görüntülemeyi kolaylaştırarak Biyomolekül etkileşimlerinin ayrıntılı karakterizasyonunu sağlar. Çift taraflı bandın ortasına 5 x 35 milimetre boyutlarında temiz bir kağıt koyun.
İki deliği ve nano desenleri kağıtla kapatmak için bandı slaydın üzerine yapıştırın. Ardından temiz bir bıçak kullanarak kağıdı kesin. Çift taraflı bandın üzerine bir cam kapak kılıfı koyun ve mikroakışkan bir oda oluşturmak için bir pipet ucu kullanarak kapak fişini ovalayın.
Birleştirilmiş akış hücresini iki mikroskop lamı arasına yerleştirin ve klipsleyin. Akış hücresini 120 santigrat derece vakumlu fırında 45 dakika pişirin. Çip bazlı analiz için sıvı konektörünü sıcak tutkal tabancası kullanarak her açık deliğe takın.
Ve iki sıra yem kilit borusunu bağlayın. Üç mililitre deiyonize su içeren bir yem kilitli şırınga bağlayın ve hazneyi yıkayın. Hazneyi damla damla bağlantı yoluyla üç mililitre lipit tamponu ile tekrar yıkayın.
Lipid tamponunda bir mililitre 0.04x biyotinillenmiş lipidi, atış başına beş dakikalık bir inkübasyonla iki atışta odaya enjekte edin. Bir mililitre BSA'da mililitre başına 0.025 miligram streptavidin enjekte edin, iki atış ve atış başına 10 dakikalık bir inkübasyon. Bir mililitre BSA tamponunda yaklaşık 30 pikomolar biyotinillenmiş lambda faj DNA'sını, iki atış ve atış başına 10 dakikalık inkübasyonlarla odaya enjekte edin.
10 mililitre görüntüleme tamponu içeren bir şırıngayı bir şırınga pompasına bağlayın ve mikroakışkan sistemdeki tüm boru hatlarındaki kabarcıkları çıkarın. Akış hücresine kabarcık enjeksiyonunu önlemek için hazırlanan akış hücresini damladan damlaya bağlantı yoluyla mikroakışkan sistemle birleştirin. Akış hücresini ve akış hücresi tutucularını birleştirin ve düzeneği özel olarak yapılmış, toplam yansıma floresan mikroskobuna monte edin.
Lambda DNA moleküllerini boyamak için 100 mikrolitre numune döngüsünden görüntüleme tamponuna 200 mikrolitre YOYO-1 boyası enjekte edin. Görüntüleme yazılımını çalıştırın ve DNA perdelerinin iyi biçimlendirilip biçimlendirilmediğini kontrol etmek için 488 nanometre lazeri açın. YOYO-1 boyası çıkarıldıktan sonra, önceden inkübe edilmiş protein örneğini enjekte edin.
Proteinler DNA perdesine ulaştığında, şırınga pompasını kapatın, kapatma valfini kapatın ve Abo1 ile histon yüklemesi için 15 dakika inkübe edin. Bağlanmamış Abo1 ve histon proteinlerini beş dakika boyunca yıkayın. Histon proteinlerinin DNA'ya yüklenip yüklenmediğini kontrol etmek için tampon akışını geçici olarak kapatın.
DNA perdesi oluşumu, DNA moleküllerinin enterpolasyonlu bir boya ile boyanmasıyla kontrol edildi. Paralel dizilerde gösterilen yeşil çizgiler, DNA moleküllerine interkalasyonlu YOYO1'in hidrodinamik akış altında bir difüzyon bariyerinde iyi hizalandığını ve gerildiğini gösterdi. Abo1'in yokluğunda DNA perdesine Cy5-H3-H4 dimerleri enjekte edildiğinde, Cy5-H3-H4 DNA'ya bağlanmadı, bu da H3-H4 dimerlerinin DNA'ya kendiliğinden bağlanmadığını gösterir.
Cy5-H3-H4'e Abo1 enjekte edildiğinde, DNA molekülleri üzerinde kırmızı floresan punkta görüldü, bu da Abo1'in H3-H4 dimerlerini DNA'ya yüklediğini düşündürdü. Floresan sinyalleri, tampon akışının yokluğunda kayboldu ve akış yeniden başlatıldığında yeniden ortaya çıktı, bu da H3-H4 dimerlerinin DNA'ya bağlandığını düşündürdü. H3-H4 dimerlerinin DNA'ya bağlanması, akış kapatıldığında floresan sinyallerinin kaybolduğu kimografi ile de doğrulandı.
DNA perdesinde, nükleotid yokluğunda veya ADP varlığında çok az floresan punkta ortaya çıktı, bu da H3-H4 dimerlerinin Apo durumunda veya ADP varlığında nadiren DNA'ya bağlandığını gösteriyor. Kantitatif analiz, ATP varlığında DNA'ya bağlı H3-H4 dimerlerinin sayısının arttığını göstermektedir. Sonuçlar, ATP hidrolizinin, Abo1 tarafından DNA'ya H3-H4 yüklemesi için gerekli olduğunu göstermektedir.
Akış hücresine kabarcık enjeksiyonundan kaçınmak, tüm adımlar için en kritik olanıdır. Yani bu protokolde, damla damla bağlantıları vurguluyoruz. DNA perdesi tahlili, çift nano desenli çift bağlı DNA perdelerine genişletilebilir.
Ek olarak, tek sarmallı DNA, RNA veya aktin filamentleri ile başka bir DNA perdesi türü yapabiliriz. DNA perdesi, DNA üzerindeki protein hareketinin görselleştirilmesini sağlar ve hedef arama mekanizmasının incelenmesini kolaylaştırır. DNA perdesi, replikasyon ve transkripsiyon dahil olmak üzere DNA metabolizmasını incelemek için uzatılabilir.
